1、轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)曾經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)根底研討和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀(jì)七八十年代誕生以來，已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)不斷以來經(jīng)久不衰，并逐漸從根底研討實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向商業(yè)方式，成為一項(xiàng)高度規(guī)范化的新興產(chǎn)業(yè)。轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)曾經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)根底研討和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀(jì)七八十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)不斷以來經(jīng)久不衰，在小鼠模型構(gòu)建方面日趨完善，并且好像剪切酶和抗體等常規(guī)分子生物學(xué)試劑的制備技術(shù)一樣，逐漸從根底研討

2、實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向商業(yè)方式，成為一項(xiàng)高度規(guī)范化的新興產(chǎn)業(yè)，催生了數(shù)以百計(jì)的創(chuàng)新藥物和數(shù)以千計(jì)的優(yōu)秀文章。雖然如此，傳統(tǒng)技術(shù)依然存在一些難以抑制的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長、勝利率低、費(fèi)用高昂等，而ZFN和TALEN等新技術(shù)的出現(xiàn)，或有能夠?qū)⑦@一局面徹底改動(dòng)?；蚯贸蠹夹g(shù)是上世紀(jì)80年代中后期基于DNA同源重組的原理開展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組homologousrecombination的原理，初次實(shí)現(xiàn)了ES的外源基因的定點(diǎn)整合targetedintegration，這一技術(shù)稱為"基因打靶"genetargeting或&a

3、mp;quot;基因敲除"geneknockout，利用這種ES的顯微注射就可以制造出基因敲出小鼠KOMice:knockoutmice;由于這一任務(wù)，Capecchi和Smithies于2019年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。同源重組homologousrecombination定義：是指發(fā)生在姐妹染色單體sisterchromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。在基因敲除小鼠制造過程中，需求針對目的基因兩端特異性片段設(shè)計(jì)帶有一樣片段的重組載體，將重組載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞后外源的重組載體與胚胎干細(xì)胞中一樣的片段會(huì)發(fā)生同源重組，如圖

4、1所示：圖2.基因敲除鼠制造過程表示圖1、Knockout載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建根據(jù)研討工程詳細(xì)情況和要求把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA片段都重組到帶有標(biāo)志基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體。2、KnockoutES細(xì)胞挑選Knockout載體測序驗(yàn)證正確后，將載體線性化，然后電轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，經(jīng)過載體上的正負(fù)挑選基因獲得陽性的KnockoutES克隆。選取PCR鑒定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用于SouthernBlot鑒定，將SouthernBlot鑒定的KnockoutES擴(kuò)展培育并液氮保管。3、KnockoutES細(xì)胞囊胚注射得到嵌合體

5、小鼠擴(kuò)增經(jīng)鑒定插入或置換片段位置正確的KnockoutES細(xì)胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數(shù)量的KnockoutES細(xì)胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，經(jīng)過小鼠的毛色中來源于ES細(xì)胞毛色的比例判別嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中能夠獲得生殖系傳送才干。4、由嵌合體小鼠繁衍出生殖遺傳系Knockout小鼠將嵌合體小鼠與適當(dāng)品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，經(jīng)過PCR方式檢測小鼠能否含有打靶序列。如有，那么該小鼠為具備生殖遺傳才干的Knockout小鼠(F1代鼠)。5、Knockout小鼠生殖系傳送鑒定將嵌合體小鼠和適當(dāng)品系野生型小鼠交配，經(jīng)過后代小鼠毛

6、色或PCR基因型鑒定的方法驗(yàn)證嵌合體小鼠生殖系傳送才干。常規(guī)基因敲除是經(jīng)過基因打靶，把需求敲除的基因的幾個(gè)重要的外顯子或者功能區(qū)域用NeoCassette交換掉。這樣的小鼠其全身一切的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因產(chǎn)物。此類基因敲除鼠普通用于研討某個(gè)基因在對小鼠全身生理病理的影響，而且這個(gè)基因沒有胚胎致死性。二、條件性基因敲除小鼠ConditionalKnockout條件性基因敲除小鼠是經(jīng)過基因打靶，把兩個(gè)loxP位點(diǎn)放到目的基因一個(gè)或幾個(gè)重要的外顯子的兩邊。該小鼠和表達(dá)Cre酶小鼠雜交之前，其目的基因表達(dá)完全正常。當(dāng)和組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)展雜交后，可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而

7、該基因在其他組織或細(xì)胞表達(dá)正常。條件性基因敲除鼠適用范圍為：1該基因有胚胎致死性；2用于研討該基因在特定的組織或細(xì)胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠Knockin一、ZFN技術(shù)制造基因敲除鼠ZFN可以識別并結(jié)合指定的基因序列位點(diǎn)，并高效準(zhǔn)確地切斷。隨后細(xì)胞利用天然的DNA修復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)DNA的插入、刪除和修正，這樣研討人員就可以隨心所欲地進(jìn)展基因組編輯。這在過去是無法想象的，傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源重組，其效率只需百萬分之一，而ZFN的基因敲除效率能到達(dá)10%。利用這些技術(shù)進(jìn)展小鼠基因的定點(diǎn)敲除和敲入，可以把時(shí)間從一年縮短到幾個(gè)月。這項(xiàng)技術(shù)中設(shè)計(jì)特異性的ZFN是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)

8、，目前研討者采用計(jì)算生物學(xué)方法設(shè)計(jì)高特異性的ZFN，但ZFN的脫靶offtarget，也就是把不該切的地方切了的問題仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。也正由于這個(gè)緣由，利用ZFN技術(shù)進(jìn)展小鼠的基因修飾還無法完全取代傳統(tǒng)技術(shù)。二、TALEN技術(shù)制造基因敲除鼠TALEN技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自一種植物細(xì)菌的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合恣意DNA序列的模塊化蛋白，從而到達(dá)靶向操作內(nèi)源性基因的目的，它抑制了ZFN方法不能識別恣意目的基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的靈敏性，使基

9、因操作變得更加簡一方便。然而同樣由于脫靶的問題，利用TALEN技術(shù)進(jìn)展小鼠的基因修飾依然無法取代傳統(tǒng)技術(shù)。一、什么是ES細(xì)胞顯微注射？答：胚胎干細(xì)胞顯微注射是制造基因敲除小鼠的一個(gè)最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎干細(xì)胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。所得嵌合體小鼠的組織，將同時(shí)含有來源于囊胚的細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。嵌合體小鼠必需和野生型小鼠配種以決議遺傳改動(dòng)的生殖系能否傳送，這樣能夠獲得轉(zhuǎn)基因或打靶基因來源于胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定的生殖系傳送的小鼠。普通情況下，大約能獲得50%承繼了目的基因的后代。二、嵌合體遺傳學(xué)上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個(gè)體。免疫學(xué)上的涵義那么指一個(gè)機(jī)體身上有

10、兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系同時(shí)存在,彼此可以耐受,不產(chǎn)生排斥反響,相互間處在嵌合形狀。在基因敲除鼠中指經(jīng)過向囊胚注射被外源基因轉(zhuǎn)化了的胚胎干細(xì)胞，使得發(fā)育成為的個(gè)體中含有不同基因型的細(xì)胞，產(chǎn)生的個(gè)體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳構(gòu)造的細(xì)胞一種是基因型被改動(dòng)了的細(xì)胞，另一種是原來的基因型的細(xì)胞。三、條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個(gè)DNA重組體系,由Cre酶和相應(yīng)的LoxP位點(diǎn)組成,它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的DNA序列處(LoxP位點(diǎn)),該系統(tǒng)可以將外源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟―NA片段刪除?；贑re-LoxP的基因打靶要分兩步來進(jìn)展。首

11、先要在胚胎干細(xì)胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以經(jīng)過打靶載體的設(shè)計(jì)和對同源重組子的挑選來實(shí)現(xiàn)。下一步經(jīng)過Cre介導(dǎo)的重組來實(shí)現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改動(dòng)。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細(xì)胞程度上用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，經(jīng)過識別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)志基因切除，又可以在個(gè)體程度上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，挑選子代小鼠就可得到刪除外源標(biāo)志基因的條件性敲除小鼠。四、如何鑒定和挑選嵌合體？答：動(dòng)物只需部分組織細(xì)胞整合有外源基因，那么稱為嵌合體動(dòng)物。它的鑒定主要根據(jù)毛色去鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據(jù)毛色的嵌合率來鑒定和挑選嵌合體。五、RO

12、SA26與定點(diǎn)插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定點(diǎn)插入到ROSA26位置。ROSA26是一個(gè)平安區(qū)域，外源性的基因定點(diǎn)插入這個(gè)位點(diǎn)不會(huì)影響其他基因的表達(dá)。TaconicFarms,Inc.成立于1952年，是位于紐約哈得孫河谷地域的一家家族企業(yè)。自成立以來，公司不斷是世界上最大的實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物供應(yīng)商之一，在繼續(xù)消費(fèi)高質(zhì)量、定義明確的大鼠和小鼠方面擁有良好的口碑。Taconic在轉(zhuǎn)基因小鼠的定制設(shè)計(jì)和消費(fèi)、小鼠和大鼠育種、屏障系統(tǒng)、基因和動(dòng)物安康方面的專業(yè)閱歷為利用活體模型開展藥物開發(fā)的研討人員提供支持。Taconic在美國和歐洲設(shè)有六個(gè)育種工廠和三個(gè)效力實(shí)驗(yàn)室，員工人