1、Chapter three Techniques of genetic engineeringChapter three六六. Different ramificate(衍生的衍生的methods of PCR1、熱啟動(dòng)、熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最特異性最重要的方法之一。重要的方法之一。 緣由：雖然緣由：雖然Taq DNA聚合酶的最正確延伸溫度在聚合酶的最正確延伸溫度在72，聚合酶在室溫依然有活性。因此，聚合酶在室溫依然有活性。因此，PCR反響體系配制過(guò)程中，反響體系配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開(kāi)場(chǎng)，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特以及在熱

2、循環(huán)剛開(kāi)場(chǎng)，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦構(gòu)成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦構(gòu)成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。 對(duì)策：對(duì)策： 限制限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反響反響液，并將其置于預(yù)熱的液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單廉價(jià)，但并不儀。這種方法簡(jiǎn)單廉價(jià)，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。擴(kuò)增。Chapter threev熱啟動(dòng)經(jīng)過(guò)抑制一種根本成分延遲熱啟動(dòng)經(jīng)過(guò)抑制一種根本成分延遲DNA合成，直到合成，直到

3、PCR儀到達(dá)變性溫度。儀到達(dá)變性溫度。v 包括延緩參與包括延緩參與Taq DNA聚合酶聚合酶; 運(yùn)用蠟防護(hù)層運(yùn)用蠟防護(hù)層將一種根本成分，如鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將一種根本成分，如鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反響成分，如模板和緩沖液，物理地隔分開(kāi)。在將反響成分，如模板和緩沖液，物理地隔分開(kāi)。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一同在一同; 聚合酶的活性需經(jīng)過(guò)聚合酶的活性需經(jīng)過(guò) 95 10mins 的高溫的高溫呵斥化學(xué)修飾基團(tuán)的零落，然后才有聚合的活性呵斥化學(xué)修飾基團(tuán)的零落，然后才有聚合的活性. Chapter three2、Touch-

4、down PCR Touch-down PCR又稱降落又稱降落PCR。即選定一個(gè)溫度范。即選定一個(gè)溫度范圍，如圍，如6550 ，每降，每降1-2 進(jìn)展進(jìn)展1-2個(gè)循環(huán)，然后個(gè)循環(huán)，然后在在50度下進(jìn)展度下進(jìn)展15個(gè)循環(huán)。個(gè)循環(huán)。 Touch-down的原理：隨著退火溫度的降低，特異的原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐漸降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)曾經(jīng)擴(kuò)增出性逐漸降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)曾經(jīng)擴(kuò)增出來(lái)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越非特異性條帶，隨著退火溫度的來(lái)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。 選擇初始復(fù)性溫度的原那么：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比

5、選擇初始復(fù)性溫度的原那么：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的引物的Tm值高出值高出5-10度，然后每個(gè)循環(huán)遞減度，然后每個(gè)循環(huán)遞減1-2度度Chapter threeTouch-down PCR的運(yùn)用范圍的運(yùn)用范圍vlow copy of targeted DNA; vhigh degree degeneracy (or less specific) of the set of primers; vRT-PCR using oligo-dT.Chapter three3、巢氏、巢氏PCRNested PCRv 巢氏巢氏PCR需求兩到三對(duì)引物，普通采用第一套引物擴(kuò)增需求兩到三對(duì)引物，普通采用第一套引物擴(kuò)增

6、15-30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增增15-30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級(jí)序列卻很少擴(kuò)增。套式引物次級(jí)序列卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性減少了引物非特異性退火，從而添加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。退火，從而添加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。v 假設(shè)將巢氏假設(shè)將巢氏PCR的內(nèi)外引物稍加改動(dòng)，延伸外引物長(zhǎng)度的內(nèi)外引物稍加改動(dòng)，延伸外引物長(zhǎng)度25-30bp，同時(shí)縮短內(nèi)引物長(zhǎng)度，同時(shí)縮短內(nèi)引物長(zhǎng)度15-17bp，使外，使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫?cái)U(kuò)增，使內(nèi)

7、引物在外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫?cái)U(kuò)增，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的根底上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴(kuò)增完成，引物擴(kuò)增的根底上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)參與。這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)參與。Chapter three4、原位PCRv 原位原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)展就是在組織細(xì)胞里進(jìn)展PCR反響，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位才干的原位反響，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位才干的原位雜交和高度特異敏感的雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù)項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù).v 原位原位PCR是是

8、Hasse等于等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新穎組織、石蠟包埋組年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新穎組織、石蠟包埋組織、零落細(xì)胞、血細(xì)胞等織、零落細(xì)胞、血細(xì)胞等.v 其根本方法為固定細(xì)胞其根本方法為固定細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處置，滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶用多聚甲醛處置，滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶.蛋白酶蛋白酶K消化處置消化處置:用用60ug/ml的蛋白酶的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片將固定好的組織細(xì)胞片55消化處置消化處置2h后，后，962min以滅以滅活蛋白酶活蛋白酶K.PCR擴(kuò)增擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，

9、加在組織細(xì)胞片上，加PCR反響液，覆蓋并加液體石蠟后，反響液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)展直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)展PCR循環(huán)擴(kuò)增循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專門(mén)用于有的基因擴(kuò)增儀帶有專門(mén)用于原位原位PCR的安裝的安裝.雜交雜交:PCR擴(kuò)增終了后，用標(biāo)志的寡核苷酸探針進(jìn)展原位雜擴(kuò)增終了后，用標(biāo)志的寡核苷酸探針進(jìn)展原位雜交交.顯微鏡察看結(jié)果顯微鏡察看結(jié)果.v 原位原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞程度上研討疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)歸有艱苦的適于分子和細(xì)胞

10、程度上研討疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)歸有艱苦的適用價(jià)值用價(jià)值.其特異性和敏感性高于普通的其特異性和敏感性高于普通的PCR. Chapter threeChapter three6、免疫、免疫-PCR(immuno-PCR)v 免疫免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng).它利用抗原它利用抗原-抗體反響的特異性和抗體反響的特異性和PCR擴(kuò)增反響的極擴(kuò)增反響的極高靈敏性來(lái)檢測(cè)抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測(cè)高靈敏性來(lái)檢測(cè)抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測(cè).v 免疫免疫-PCR實(shí)驗(yàn)的主要步驟有三個(gè)實(shí)驗(yàn)的主要步驟有三個(gè):

11、抗原抗原-抗體反響，與抗體反響，與嵌合銜接分子結(jié)合，嵌合銜接分子結(jié)合，PCR擴(kuò)增嵌合銜接分子中的擴(kuò)增嵌合銜接分子中的DNA(普通普通為質(zhì)粒為質(zhì)粒DNA).該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合銜接分子的制備該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合銜接分子的制備.在免疫在免疫-PCR中，嵌合銜接分子起著橋梁作用，它有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一中，嵌合銜接分子起著橋梁作用，它有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個(gè)與質(zhì)粒個(gè)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個(gè)與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其結(jié)合，其根本原理與根本原理與ELISA和免疫酶染色類似，不同之處在于其中的標(biāo)和免疫酶染色類似，不同之處在于其中的標(biāo)志物不是酶而是質(zhì)粒志物不是酶而是質(zhì)粒DN

12、A，在操作反響中構(gòu)成抗原抗體，在操作反響中構(gòu)成抗原抗體-銜接銜接分子分子-DNA復(fù)合物，經(jīng)過(guò)復(fù)合物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA來(lái)判別能否存在特異性來(lái)判別能否存在特異性抗原抗原.v 免疫免疫PCR優(yōu)點(diǎn)為優(yōu)點(diǎn)為:特異性較強(qiáng)，由于它建立在抗原抗體特異性較強(qiáng)，由于它建立在抗原抗體特異性反響的根底上特異性反響的根底上.敏感度高，敏感度高，PCR具有驚人的擴(kuò)增才干，具有驚人的擴(kuò)增才干，免疫免疫PCR比比ELISA敏感度高敏感度高105倍以上，可用于單個(gè)抗原的檢倍以上，可用于單個(gè)抗原的檢測(cè)測(cè).操作簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)便，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒擴(kuò)增質(zhì)粒DNA比擴(kuò)增靶基因容易得多，比擴(kuò)增靶基因容易得多，普通實(shí)驗(yàn)室均能進(jìn)展普通實(shí)驗(yàn)

13、室均能進(jìn)展 Chapter threev自從自從1988年，年，Chamberlain研討闡明研討闡明PCR可以同可以同時(shí)擴(kuò)增人類肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因多個(gè)基因座以來(lái)，時(shí)擴(kuò)增人類肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因多個(gè)基因座以來(lái)，多重多重PCR技術(shù)得到研討人員的廣泛關(guān)注，并且曾技術(shù)得到研討人員的廣泛關(guān)注，并且曾經(jīng)逐漸開(kāi)展成為一種通用技術(shù)。如今，多重經(jīng)逐漸開(kāi)展成為一種通用技術(shù)。如今，多重PCR技術(shù)曾經(jīng)廣泛的運(yùn)用于病原體鑒定、性別挑選、技術(shù)曾經(jīng)廣泛的運(yùn)用于病原體鑒定、性別挑選、連鎖分析、法醫(yī)研討、模板定量和遺傳疾病診斷連鎖分析、法醫(yī)研討、模板定量和遺傳疾病診斷之中。之中。 7、多重PCRChapter threev多重

14、多重PCRmultiplex polymerase chain reaction， MPCR也稱為復(fù)合也稱為復(fù)合PCR，是在常規(guī)，是在常規(guī)PCR的根底之上進(jìn)展改良從而開(kāi)展起來(lái)的一種新的根底之上進(jìn)展改良從而開(kāi)展起來(lái)的一種新型的型的PCR擴(kuò)增技術(shù)，多重?cái)U(kuò)增技術(shù)，多重PCR技術(shù)的根本原理與技術(shù)的根本原理與常規(guī)的常規(guī)的PCR技術(shù)一樣。技術(shù)一樣。v多重多重PCR技術(shù)主要有兩種方式：一、將多條引物技術(shù)主要有兩種方式：一、將多條引物和多個(gè)模板和多個(gè)模板DNA混合在同一個(gè)反響體系中分別特混合在同一個(gè)反響體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，常用于突變?nèi)笔z測(cè)、異擴(kuò)增不同的目的條帶，常用于突變?nèi)笔z測(cè)、多態(tài)分析等；

15、二、將多條引物和單一的模板多態(tài)分析等；二、將多條引物和單一的模板DNA混合在同一反響體系中擴(kuò)增同一模板的不同片段，混合在同一反響體系中擴(kuò)增同一模板的不同片段，常用于對(duì)超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。常用于對(duì)超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。Chapter threev 多重多重PCR的優(yōu)點(diǎn)：高效性，在同一的優(yōu)點(diǎn)：高效性，在同一PCR反響管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生反響管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)展分型，且所需模板或樣品量極少，運(yùn)物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)展分型，且所需模板或樣品量極少，運(yùn)用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。系統(tǒng)性，多重用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。系統(tǒng)性，多重PCR很適宜對(duì)病癥一樣或很適宜對(duì)病癥

16、一樣或容易污染一樣食品的一組病原菌進(jìn)展分析，即適宜對(duì)成組病原體進(jìn)展檢測(cè)，容易污染一樣食品的一組病原菌進(jìn)展分析，即適宜對(duì)成組病原體進(jìn)展檢測(cè)，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無(wú)芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無(wú)芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時(shí)檢測(cè)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反響管內(nèi)同時(shí)檢出，菌戰(zhàn)劑的同時(shí)檢測(cè)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反響管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支，為臨床或食品平安檢測(cè)提將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支，為臨床或食品平安檢測(cè)提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。v 多重多重PCR的缺乏：靈敏性和

17、檢測(cè)的特異性低的缺乏：靈敏性和檢測(cè)的特異性低 需求優(yōu)先擴(kuò)增某一特定需求優(yōu)先擴(kuò)增某一特定片段片段 容易構(gòu)成引物二聚體。多重容易構(gòu)成引物二聚體。多重PCR要求不同的引物能在同一反響體要求不同的引物能在同一反響體系中進(jìn)展各自的特異性擴(kuò)增，但是它的體系建立和條件優(yōu)化過(guò)程需求較長(zhǎng)系中進(jìn)展各自的特異性擴(kuò)增，但是它的體系建立和條件優(yōu)化過(guò)程需求較長(zhǎng)的時(shí)間，所以在一定程度上限制了該方法的推行運(yùn)用。的時(shí)間，所以在一定程度上限制了該方法的推行運(yùn)用。Chapter threev面臨的問(wèn)題：面臨的問(wèn)題： 在多重在多重PCR的反響體系中，由于涉的反響體系中，由于涉及到的引物比較多，因此比較容易呵斥引物二聚及到的引物比較多

18、，因此比較容易呵斥引物二聚體、錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增等景象，從而降低擴(kuò)增體、錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增等景象，從而降低擴(kuò)增反響的效率。所以在建立一個(gè)多重反響的效率。所以在建立一個(gè)多重PCR反響體系反響體系的時(shí)候，需求對(duì)設(shè)計(jì)的引物，反響體系的組成和的時(shí)候，需求對(duì)設(shè)計(jì)的引物，反響體系的組成和PCR循環(huán)條件等進(jìn)展反復(fù)的探求，并進(jìn)展優(yōu)化。循環(huán)條件等進(jìn)展反復(fù)的探求，并進(jìn)展優(yōu)化。Chapter three8.反向反向PCR：常規(guī)常規(guī)PCR只能擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的只能擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA區(qū)段，但有時(shí)區(qū)段，但有時(shí)我們想知道基因之外的兩側(cè)未知我們想知道基因之外的兩側(cè)未知DNA序列，這樣就序列，這樣就出現(xiàn)了反向出現(xiàn)了反向PCR。反向反向PCR首先將首先將DNA用限制性內(nèi)切酶切割，切割要用限制性內(nèi)切酶切割，切割要堅(jiān)持知序列兩端有未知序列，進(jìn)展環(huán)化，然后用引堅(jiān)持知序列兩端有未知序列，進(jìn)展環(huán)化，然后用引物進(jìn)展擴(kuò)增。產(chǎn)物是知序列以外的序列。物進(jìn)展擴(kuò)增。產(chǎn)物是知序列以外的序列。Chapter three9.PCRRFLP(restriction fragment length polymorphism) 是一種借助于限制性內(nèi)切酶對(duì)是一種借助于限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增片斷進(jìn)展酶擴(kuò)增片斷進(jìn)展酶切分析的方法。用于鑒定分類。切分析的方法。用于鑒定分類?；蛴斜Ｊ貐^(qū)，有可變區(qū)，我們可以