1、第四章第四章 PCR引物設計引物設計及測序結果分析及測序結果分析Contentp聚合酶鏈式反應（聚合酶鏈式反應（PCR） 的技術的技術原理及結果分析原理及結果分析pPCR引物設計原理及相關軟件的使引物設計原理及相關軟件的使用（用（ Primer Premier 5.0 ）p測序結果分析測序結果分析一一 . PCR的技術原理及結果分析的技術原理及結果分析v聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應(polymerase chain (polymerase chain reaction,PCRreaction,PCR) )，是一種在體外快速擴增特定基因或，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法序列的方法

2、，故又稱為基因的體外擴增法。，故又稱為基因的體外擴增法。vPCR不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構建，基因表達調析，還可以用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。 PCR技術原理技術原理 以擬擴增的以擬擴增的DNADNA分子為模板，以一對分別與分子為模板，以一對分別與模板模板55末端和末端和33末端互補的寡核苷酸片段為引末端互補的寡核苷酸片段為引物

3、，在物，在DNADNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNADNA合成，重復這合成，重復這一過程，即可使目的一過程，即可使目的DNADNA片段得到擴增。片段得到擴增。正義鏈正義鏈反義鏈反義鏈基本分子生物學研究手段基本分子生物學研究手段PCRPCRPCR反應液體的成分反應液體的成分: :PCRPCR循環(huán)的程序循環(huán)的程序: :PCRPCR原理：原理：基本分子生物學研究手段基本分子生物學研究手段RT-PCR反轉錄反轉錄PCRmRNA-cDNA-PCR基本分子生物學研究手段基本分子生物學研究手段Cutting

4、by enzymes 基本分子生物學研究手段基本分子生物學研究手段Southern Blot基本分子生物學研究手段基本分子生物學研究手段Northern Blot模板與引物的復性,引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段。Tm在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA94C從結合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，按53的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈72C變性退火延伸 PCRPCR出現(xiàn)的問題：出現(xiàn)的問題： PCRPCR擴增未得到目的條帶？擴增未得到目的條帶？ 擴增出目的條帶之外的多條帶（非特異性擴增出目的條帶之外的多條帶（非特異性）？）？ 擴增的目的條帶很弱？擴增的目的條

5、帶很弱？引物是否合適?引物設計是引物設計是PCR 技術中至關重要的一環(huán)技術中至關重要的一環(huán)PCR結果分析結果分析PCR結果。結果。12、PCR產物（產物（3ul樣品）樣品）1. 1. 無擴增產物無擴增產物 模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 Buffer對樣品不合適對樣品不合適 引物設計不當或者發(fā)生降解引物設計不當或者發(fā)生降解 退火溫度太高退火溫度太高2. 2. 非特異性擴增非特異性擴增 引物特異性差引物特異性差 模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高 酶量過多酶量過多 退火溫度偏低退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多3. 3. 拖尾拖尾產物在凝膠上呈產物在凝膠上呈Smear狀態(tài)狀

6、態(tài) M 1 2模板不純或降解模板不純或降解BufferBuffer不合適不合適退火溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多4. 假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況)交叉污染交叉污染 對策對策 操作時防止將靶序列吸入加樣槍內或操作時防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；濺出離心管外； 除不能耐高溫的物質外，所有試劑器除不能耐高溫的物質外，所有試劑器材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次性使用。性使用。 各種試劑先進行分裝，低溫貯存。各種試劑先進行分裝，低溫貯存。

7、 設置陽性和陰性對照，重復實驗設置陽性和陰性對照，重復實驗1、目的基因的克隆：、目的基因的克?。?PCR技術為在重組技術為在重組DNA過程中獲得目的基過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。因片段提供了簡便快速的方法。 2、基因的體外突變：、基因的體外突變：可以隨意設計引物在體外對目的基因片段可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。進行嵌和、缺失、點突變等改造。PCR的應用的應用3、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析：PCR技術高度敏感，對模板的含量要求很低技術高度敏感，對模板的含量要求很低，是，是DNA和和NA微量分析的最好方法。實際工作中，微量分析的最好方

8、法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細胞已足以滿足一滴血液、一根毛發(fā)或一個細胞已足以滿足PCR的檢的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應用前景。測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應用前景。4、基因轉錄水平檢測、基因轉錄水平檢測RT-PCR可檢測不同組織或細胞中基因的轉錄水平可檢測不同組織或細胞中基因的轉錄水平.5、基因突變分析：、基因突變分析：利用利用PCR與一些技術的結合可以大大提高基因突與一些技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。變檢測的敏感性。二二. PCR引物設計原理及相關軟件的使用引物設計原理及相關軟件的使用（ Primer Premier 5.0 ）v引物引物v

9、引物的重要性引物的重要性v引物設計的原則引物設計的原則v引物同源性分析引物同源性分析v引物設計軟件引物設計軟件v如何使用如何使用Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0v酶切位點及保護堿基的添加酶切位點及保護堿基的添加引物（引物（primers)v引物是人工合成的兩段寡引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條的另一條DNA模板鏈互補模板鏈互補。(上游引物與上游引物與DNA序列一序列一致致,下游引物要反相互

10、補下游引物要反相互補.)3355Sense primerAntisense primer引物的重要性引物的重要性v在整個在整個PCR體系中體系中, 引物占有十分重要的引物占有十分重要的地位。地位。PCR的特異性要求引物與靶的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的特異結合，不與其他非目的DNA結合，結合，PCR的靈敏性要求的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。結果密切相關。引物設計原則引物設計原則v引物長度引物長度 v堿基分布的均衡性堿基分布的均衡性vTm值值v引物二級結構引物二級結構v引物

11、引物3端端v引物引物5端端v引物的內部穩(wěn)定性引物的內部穩(wěn)定性v引物的保守性與特異性引物的保守性與特異性v擴增區(qū)域的二級結構擴增區(qū)域的二級結構引物與模板的序列要引物與模板的序列要緊密互補緊密互補引物與引物之間避免形成引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構或發(fā)夾結構引物不能在模板的非目的位點引發(fā)引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA DNA 聚合反應聚合反應( (即錯配即錯配) )。 基本原則：基本原則：引物長度（引物長度（primer lengthprimer length）產物長度（產物長度（product lengthproduct length）序列序列Tm Tm 值值(m

12、elting temperature)(melting temperature)形成引物二聚體形成引物二聚體(primer dimer)(primer dimer)及發(fā)夾結構（及發(fā)夾結構（duplex formation and hairpinduplex formation and hairpin）的能值）的能值在錯配位點（在錯配位點（false priming sitefalse priming site）的引發(fā)效率）的引發(fā)效率引物及產物的引物及產物的GCGC含量（含量（compositioncomposition）具體因素：具體因素：一般原則：一般原則：1. 引物的長度引物的長度：配對引

13、物的長度一般在：配對引物的長度一般在15-30bp之間比較合適。之間比較合適。v 盡可能使用兩條引物的盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過值相同（最好相差不要超過 5） vTm值的計算值的計算：一般的公式：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的引物的GC%含量含量：一般為：一般為40%-60%。上。上下游引物的下游引物的GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。3. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是尤其是3端相似性較高的序列，否則容易端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。導致錯配。4. 引物引物3端的末位堿基

14、避開密碼子的第端的末位堿基避開密碼子的第3位，位，且最好不選擇且最好不選擇A5. 引物的引物的5端可以修飾，而端可以修飾，而3端不可修飾。端不可修飾。 6. 引物無回文對稱結構，否則會形成發(fā)夾引物無回文對稱結構，否則會形成發(fā)夾結構；引物自身不能配對，否則易形成約結構；引物自身不能配對，否則易形成約兩個引物長度的引物二聚體；兩個引物長度的引物二聚體； 發(fā)夾結構發(fā)夾結構引物二聚體引物二聚體7. 引物引物5端可以有與模板端可以有與模板DNA不配對堿基不配對堿基，在，在5端引入一段非模板依賴性序列。端引入一段非模板依賴性序列。5端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切位端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切

15、位點點5端加上適當數(shù)量的保護堿基）。端加上適當數(shù)量的保護堿基）。5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產物端的某一位點修改某個堿基，人為地在產物中引入該位點的點突變以作研究。中引入該位點的點突變以作研究。5端標記放射性元素或非放射性物質（如生物端標記放射性元素或非放射性物質（如生物素、地高辛等）。素、地高辛等）。8. 引物的保守性與特異性引物的保守性與特異性v保守性：通用引物保守性：通用引物檢測同一類病原微生物盡可檢測同一類病原微生物盡可能多的型別能多的型別v特異性：避免非特異性擴增特異性：避免非特異性擴增引物同源性分析引物同源性分析v用用Blastn軟件進行同源性比較軟件進行同源性比較盡可能選

16、擇與非目的基因同源性小的序列作為盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物引物選擇選擇3端與非目的基因不同源的序列作為引物端與非目的基因不同源的序列作為引物引物設計軟件引物設計軟件vPrimer Premier 5.0 生物軟件網下載生物軟件網下載安裝后，用文本編輯器打開安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將，將vspace=DU改為改為vspace=PU便可以使用全部功能。便可以使用全部功能。 vOligovprimer 3vThe Primer GeneratorvNetPrimer如何使用如何使用Primer Premier 5.0v引物設計引物設計一般引物設計一般引物設計5帶酶切

17、位點引物設計帶酶切位點引物設計巢式巢式PCR引物設計引物設計多重多重PCR引物設計引物設計v探針設計探針設計v引物評析引物評析Primer Premier 5.0主要功能主要功能:1 1、引物設計、引物設計2 2、限制性內切酶位點分析、限制性內切酶位點分析3 3、DNA DNA 基元基元(motif)(motif)查找查找4 4、同源性分析、同源性分析Primer Premier 5.0使用介紹使用介紹Preimer Premier 啟動界面Load sequencehttp:/Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to tran

18、slate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8種密碼子偏好Choose a function 引物設計界面引物設計界面引物設計界面引物設計界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索選項設定引物搜索選項設定引物類型搜索模式5引物位置范圍3引物位置范圍產物大小范圍引物長度搜索結果搜索結果28對引物引物分值100分為滿分每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息引物信息回到主窗口引物及產物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimer引物編輯引物編輯引物編輯引物編輯編輯引物分析引物結果確認編輯的引物 酶切位點及保護堿基的添加酶切位點及保護堿基的添加酶切位點的查找酶切位點的查找酶切位點的選擇原則酶切位點的選擇原則:1.DNA序列當中不含有該酶切位點序列當中不含有該酶切位點.2.載體中只在多克隆位點含有該酶切位點載體中只在多克隆位點含有該酶切位點.3. 按照酶