1、常用蛋白質(zhì)相互作用技常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)介紹術(shù)介紹SPR技術(shù)分析蛋白質(zhì)相互作用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯 coupled transcription/translation reaction 偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程 continuous exchange cell-free (CECF) principle 持續(xù)交換和非細(xì)胞體系的原理 偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程T7-RNA polymeraseT7-RNA polymeraseE.coliE.coli lysate lysategeneDNADNAcoupled transcription / coupled transcription / translati

2、ontranslationproteinproteingene持續(xù)交換和非細(xì)胞體系的原理T7 RNA polymeraseTranslation machinery E. coliEnergy regenerating systemProteinDNA templateAmino acidsEnergy substratesBuffer componentsNTPsSupplySupplyAmino acidsEnergy substratesBuffer componentsNTPsSupplySupplyInhibitory by-productsInhibitory by-product

3、sInhibitory by-productsInhibitory by-productsmembranemembranemembranemembrane供給腔 反應(yīng)腔 供給腔microtiter-platePCR tubesRTS 500devicesmicrocentrifugetubes4x12 4x12 RTS 100RTS 1008x 8x 96x 96x RTS 100RTS 100RTS500 RTS500 反應(yīng)裝置reaction chamberfeeding chamberwithsemipermeable membranesRTS 500 ProteoMaster E. c

4、oli HY Kit 質(zhì)譜 X射線結(jié)晶學(xué)核磁共振 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的蛋白標(biāo)記the amino acids and methionine are both provided separately from all other kit reagentsother desired aminoother desired amino acidsacids can be exchanged by using the RTS Amino Acid SamplerRTS Amino Acid Sampler in combination with the RTS 500 HY RTS 500 HYRTS 500

5、HYMethionine specific labeling of proteins is possible by substituting the substituting the methioninemethionineor結(jié)構(gòu)分析GST融合蛋白鑒定蛋白質(zhì)相互作用GST PULL-DOWN：通過與GST融合蛋白質(zhì)探針蛋白質(zhì)相互作用從可溶性蛋白質(zhì)庫中親和純化一個(gè)未知蛋白質(zhì)，再通過GST與谷光苷肽偶聯(lián)球珠的結(jié)合收集相互作用蛋白質(zhì)，從而分離出蛋白質(zhì)復(fù)合物。 1 含有表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)；2 誘導(dǎo)表達(dá)；3 收集菌體；4 加蛋白酶抑制劑，冰上破碎細(xì)胞；5 離心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽瓊脂糖球珠

6、，在4C，溫和混勻30分鐘；6 離心收集瓊脂糖球珠，用PBS輕輕混勻懸浮，反復(fù)三次；7 將混合物裝柱，讓PBS流出；8 加還原性的GSH將融合蛋白洗脫；9 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純化情況。注意：絕大部分工作應(yīng)在注意：絕大部分工作應(yīng)在4C4C進(jìn)行；對(duì)照？進(jìn)行；對(duì)照？GST融合蛋白純化基本程序免疫共沉淀鑒定蛋白質(zhì)相互作用當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)之間的結(jié)合保持下來，因而可以據(jù)此檢測(cè)生理?xiàng)l件下相關(guān)蛋白質(zhì)間的相互作用。如果蛋白質(zhì)X用其抗體免疫沉淀，在細(xì)胞內(nèi)與X穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下來。蛋白質(zhì)Y的沉淀是基于與X的物理相互作用，被稱為免疫共沉淀。注意：絕大部分工作應(yīng)在注意

7、：絕大部分工作應(yīng)在4C4C進(jìn)行；對(duì)照？進(jìn)行；對(duì)照？串聯(lián)親和純化鑒定蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)復(fù)合體Tandem affinity purification-TAP將靶蛋白與蛋白質(zhì)標(biāo)簽融合并在天然宿主細(xì)胞中表達(dá)，制備提取物，然后采用標(biāo)準(zhǔn)的兩步法重獲靶蛋白及與其相互作用的蛋白質(zhì)組份。成像的方法鑒定蛋白質(zhì)相互作用；噬菌體表面展示鑒定蛋白質(zhì)相互作用；原子力顯微鏡檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用；計(jì)算機(jī)方法；化學(xué)交聯(lián)技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)相互作用等等。其它方法microtiter-platePCR tubesRTS 500devicesmicrocentrifugetubes4x12 4x12 RTS 100RTS 1008x 8x 96x 96x RTS 100RTS 100RTS500 RTS500 反應(yīng)裝置reaction chamberfeeding chamberwithsemipermeable membranesRTS 500 ProteoMaster E. coli