1、報(bào)告基因分析1. 基本概念和實(shí)驗(yàn)原理基本概念和實(shí)驗(yàn)原理 報(bào)告基因報(bào)告基因: 編碼可供檢測的酶與蛋白質(zhì)的基編碼可供檢測的酶與蛋白質(zhì)的基因。是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于分因。是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于分析析結(jié)構(gòu)基因旁側(cè)區(qū)域結(jié)構(gòu)基因旁側(cè)區(qū)域潛在的順式元件潛在的順式元件(如啟如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子等動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子等)和反式作用因子和反式作用因子相互作用關(guān)系的一種重要工具。相互作用關(guān)系的一種重要工具。 可作為報(bào)告基因的條件可作為報(bào)告基因的條件: 編碼產(chǎn)物的活性不受宿主細(xì)胞的干預(yù)。編碼產(chǎn)物的活性不受宿主細(xì)胞的干預(yù)。 編碼產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中不存在編碼產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中不存在, 易于區(qū)別。易于區(qū)別。

2、 編碼產(chǎn)物的活性的測定必須具有快速、簡便、編碼產(chǎn)物的活性的測定必須具有快速、簡便、 靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。 常用的報(bào)告基因：常用的報(bào)告基因：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)、 -gal、熒光酶基因熒光酶基因(Luc) )2. 用途：用途： 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究：最初的功能。基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究：最初的功能。 作為分子標(biāo)記的應(yīng)用：如利用作為分子標(biāo)記的應(yīng)用：如利用 GFP 作為標(biāo)記物檢作為標(biāo)記物檢測基因在植物測基因在植物 酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移。酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移。 生物大分子之間的相互作用：激活劑或拮抗劑在生物大分子之間的相互作用：激活劑或

3、拮抗劑在改變活細(xì)胞中受體活性作用等方面的研究。改變活細(xì)胞中受體活性作用等方面的研究。其他方面的應(yīng)用：其他方面的應(yīng)用：RNA 干擾研究、影像技術(shù)及藥干擾研究、影像技術(shù)及藥物篩選等。物篩選等。3. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)：實(shí)驗(yàn)技術(shù)： 基因克隆基因克隆 轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞 產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測基因克隆的特點(diǎn)和技術(shù)路線基因克隆的特點(diǎn)和技術(shù)路線 特點(diǎn)：分子水平上操作，細(xì)胞水平上表達(dá)特點(diǎn)：分子水平上操作，細(xì)胞水平上表達(dá) 技術(shù)路線：技術(shù)路線： 1 分離分離制備目的制備目的DNA片段和載體片段和載體 2 目的目的DNA與載體的與載體的剪切剪切 3 目的目的DNA與載體的與載體的連接連接 4 重組重組DNA分子分子轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

4、宿主細(xì)胞 5 篩選篩選陽性克隆，大量擴(kuò)增陽性克隆，大量擴(kuò)增 在這個(gè)過程中：在這個(gè)過程中： 1.“基因剪刀基因剪刀” 剪剪切切DNA的酶就像一把的酶就像一把“基因剪刀基因剪刀” 2.“縫紉針縫紉針” 連接不同來源連接不同來源DNA分子的酶就像一根分子的酶就像一根“縫紉針縫紉針”，使二，使二者連在一起者連在一起 3.“交通工具交通工具” 使用載體好比一輛車子使用載體好比一輛車子 4.“乘客乘客” 有用基因如有用基因如IL2好比乘客，車子把乘客送進(jìn)理想天堂好比乘客，車子把乘客送進(jìn)理想天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治

5、療（品或開展基因治療（IL2/LAK抗癌）?？拱Ｒ?、目的基因的獲取一、目的基因的獲取直接從染色體直接從染色體DNA中分離中分離通過通過mRNA反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA從基因組從基因組DNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 PCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因人工體外合成基因片段人工體外合成基因片段 二、載體二、載體u定義：定義：能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的一類增和表達(dá)的一類DNA分子。分子。u特性：特性：1 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) (ori) 2 多克隆位點(diǎn)：多種限制酶的單一切割位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)：多種限制酶的

6、單一切割位點(diǎn)3 篩選標(biāo)志篩選標(biāo)志 Amp+ Kan+ Neo+4 分子量不宜過大分子量不宜過大 否則易斷裂、轉(zhuǎn)化效率低否則易斷裂、轉(zhuǎn)化效率低5 表達(dá)載體還要有表達(dá)載體還要有P、E、前導(dǎo)序列、加尾信號、前導(dǎo)序列、加尾信號、信號肽、核定位序列等信號肽、核定位序列等 載體的分類載體的分類分類依據(jù)分類依據(jù) 類類 別別克隆擴(kuò)增或表達(dá)克隆擴(kuò)增或表達(dá)舉舉 例例1.按功能分成按功能分成（1）克隆載體）克隆載體（2）表達(dá)載體）表達(dá)載體 PBR322PCDN32.按進(jìn)入受體細(xì)胞類按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分型分（1）原核載體）原核載體（2）真核載體）真核載體（3）穿梭載體）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE3.按載體來

7、源分按載體來源分質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體 病毒載體病毒載體pGEX-4TM13pAdV54.按克隆片段得大小按克隆片段得大小（克隆能力）分（克隆能力）分(1)1kb (2)10kb (3)22kb(4)50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb( 1 ) M 1 3 (2)plasmid(3)phage(4)casmid( 5 ) B A C (6)YAC常用的報(bào)告基因載體類型：常用的報(bào)告基因載體類型：1）basic 載體：不含載體：不含 P/E,用于檢測啟動(dòng)用于檢測啟動(dòng)子活性。子活性。2）control載體：含啟動(dòng)子，用于檢測增載體：含啟動(dòng)子，用于檢測增強(qiáng)子或沉默子

8、的活性。強(qiáng)子或沉默子的活性。u 酶切注意事項(xiàng)酶切注意事項(xiàng)（最好雙酶切）（最好雙酶切） 酶的保存：低溫保存，冰上操作。貯存環(huán)境是甘油，酶的保存：低溫保存，冰上操作。貯存環(huán)境是甘油，避免反復(fù)凍融。避免反復(fù)凍融。 酶切反應(yīng)體系：酶量不能超過反應(yīng)體積的酶切反應(yīng)體系：酶量不能超過反應(yīng)體積的1/10。 反應(yīng)緩沖液：合適的反應(yīng)緩沖液：合適的pH值、鹽離子濃度，值、鹽離子濃度，配套提供。配套提供。 DNA樣品要求：一定純度和濃度，不能混有酚、氯樣品要求：一定純度和濃度，不能混有酚、氯仿、仿、 EDTA、 SDS、 過多鹽類等。過多鹽類等。 溫度和時(shí)間：通常溫度和時(shí)間：通常37 1-2h 反應(yīng)終止：反應(yīng)終止：E

9、DTA 、SDS 、加熱、加熱 、直接放入、直接放入 -20 操作要求：無菌新的操作要求：無菌新的dorf管、槍頭、去離子三蒸水。管、槍頭、去離子三蒸水。 電泳鑒定酶切是否完全電泳鑒定酶切是否完全 。u連接連接-定向克?。ㄗ畛Ｓ茫┒ㄏ蚩寺。ㄗ畛Ｓ茫┓椒ǎ弘p酶切方法：雙酶切 優(yōu)點(diǎn)：防止載體自身環(huán)化優(yōu)點(diǎn)：防止載體自身環(huán)化 正向插入正向插入 單拷貝插入單拷貝插入 連接效率高連接效率高轉(zhuǎn)化的原理和過程轉(zhuǎn)化的原理和過程 感受態(tài)感受態(tài)：細(xì)菌處于容易吸收外源：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)。的狀態(tài)。 致敏致敏：用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操：用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作。作。 轉(zhuǎn)化過程：轉(zhuǎn)化過程：

10、1 對數(shù)期細(xì)菌置于冷對數(shù)期細(xì)菌置于冷Cacl2、Mgcl2中，制備感中，制備感受態(tài)受態(tài)2 加入重組質(zhì)粒，冰浴加入重組質(zhì)粒，冰浴30分鐘，不要震蕩分鐘，不要震蕩3 42水浴水浴6090S，熱休克，熱休克4 馬上冰浴馬上冰浴第七節(jié)第七節(jié) 篩篩u抗藥性篩選：抗藥性篩選：ampr tetr kanru插入表達(dá)篩選插入表達(dá)篩選:u藍(lán)白斑篩選：藍(lán)白斑篩選：u測序測序u菌落或噬菌斑雜交篩選菌落或噬菌斑雜交篩選u酶切鑒定：插入否？插入方向？酶切鑒定：插入否？插入方向？轉(zhuǎn)染 ：指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程 。若此DNA未與宿主細(xì)胞DNA整合而獲表達(dá)，稱“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transient tr

11、ansfection)”；若與宿主細(xì)胞DNA整合并隨后者的復(fù)制而復(fù)制稱“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stable transfection)”。 轉(zhuǎn)染方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。轉(zhuǎn)染方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。 注意事項(xiàng)：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。 電擊法電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法磷酸鈣法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞。脂質(zhì)