1、主講：葉晨 陳炳宏（麻醉1201） 每當我走進父親的辦公室，總會看見他桌上放著的一些培養(yǎng)皿，里面裝的是菌群。它們就象一個住著許多居民的城市，在每一種細菌中都有一個國王，他長得瘦瘦的、高高的。國王有很多仆人，這些仆人長得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父親把國王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。國王就像一本書，仆人們做的每一件事情在這本書中都有記載。對于我們人類來說，國王記載的這些細目是個謎。 我爸爸已經發(fā)現(xiàn)了其中的一個仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外國國王來侵犯一個細菌，這個仆人就會把他剪成小碎片，但他不會對自己的國王造成任何傷害。 聰明的人類用這個帶著剪刀的仆人來探究國王的秘密，他們搜集了很多帶

2、剪刀的仆人，并把他們放進一個國王里，這個國王就被剪成了碎片。用這種方法得到的小碎片使人類探究國王的秘密變得容易了。爸爸就是因為發(fā)現(xiàn)了帶著剪刀的仆人而獲得了諾貝爾獎。 限制性核酸內切酶發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶發(fā)現(xiàn) 這是瑞士微生物遺傳學家W阿爾伯（1929）的女兒西爾維婭（當時10歲）在聽完父親給她講完限制性內切酶后寫下的一個故事，限制性內切酶就是故事中帶剪刀的仆人。 限制性內切酶能夠在DNA上尋找特定的“切點”，認準后將DNA分子的雙鏈交錯地切斷。因此，限制性內切酶被稱為“分子剪刀”，它可以完整地切下個別基因。 1965年，阿爾伯首次從理論上提出了生物體內存在具有切割基因功能的限制性內切酶。并于19

3、68年成功分離出I型限制性內切酶，但這種酶的切割基因功能不理想。1970年，美國分子生物學家、遺傳學家HO史密斯（1931）分離出了II型限制性內切酶。1971年，美國微生物遺傳學家D內森斯（1928）使用II型限制性內切酶首次完成了對基因的切割。他們的研究成果為人類在分子水平上實現(xiàn)人工基因重組提供了有效的技術手段，他們于1978年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。 DNA限制性內切酶原理酶切反應實驗步驟影響因素結果分析討論核酸限制性內切酶（restriction enzyme）是一類能識別雙鏈DNA特定堿基序列的核酸水解酶。能識別雙鏈DNA分子內部的特異位點并裂解磷酸二酯鍵。特異位點：特定的堿基序列

4、，通常是46個堿基對、具有回文序列的DNA片段，大多數(shù)酶是錯位切割雙鏈DNA分子，產生5或3粘性末端。磷酸二酯鍵：一種化學基團，指一分子磷酸與兩個醇（羥基）酯化形成的兩個酯鍵。該酯鍵成了兩個醇之間的橋梁。例如一個核苷的3羥基與另一個核苷的5羥基與同一分子磷酸酯化，就形成了一個磷酸二酯鍵。一、實驗原理一、實驗原理限制性核酸內切酶都是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的，可以為宿主抵御外來DNA的侵襲。根據酶的切割特性、催化條件及是否具有修飾性可分為I、II、III型三大類。I型酶具有核酸內切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四種活性。其內切酶的識別位點和切割部位不一致，相距幾千個堿基，無固定的切割位點，不產生特

5、異片斷。III型酶和I型酶類似，也有甲基化功能，但無ATP酶和DNA解旋酶活性。此類酶可在DNA鏈的特異位點切割，但切割位點在識別位點之外，一般相距幾十個堿基，對基因工程的意義也不大。分類分類 II型酶限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶組成。II型限制酶需要Mg2+作為催化反應輔助因子，能識別雙鏈DNA的特定序列，一般為4-6個堿基的反轉重復序列。II型限制酶一般在識別序列內進行切割，產生特異的DNA片斷。 II型修飾酶識別和II型限制酶一致的DNA序列，但其作用是負責對識別序列的甲基化修飾。 基因工程中使用的DNA限制性內切酶 II型限制酶切割DNA雙鏈可產生三種不同的DNA末端：平末端、5端

6、突出的粘性末端、和3端突出的粘性末端。BamH I識別及切割位點： 5GGATC C3 3C CTAGG5 5G3 5GATCC3 3CCTAG5 3G5Xho I識別及切割位點：5CTCGA G3 3G AGCTC5 二、二、限制性內切酶酶切反應1.配制反應體系 DNA：必須具備一定純度，微量的酚、氯仿、大于10mM的EDTA、去垢劑、及高鹽的存在均將影響限制性內切酶的活性。DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的重要因素。 反應緩沖液：不同廠家、不同的酶都有不同的最佳反應條件。應嚴格按照產品說明書操作。雙酶切時要選擇兩種酶都具有最高活性的緩沖液。 反應容積：在DNA濃度0.4g/l的情況下，

7、根據后續(xù)實驗的要求選擇合適的反應容積。過高濃度的DNA會使溶液過于粘稠影響酶的擴散，并降低酶活性。 內切酶及使用的酶量根據實驗要求選擇限制性內切酶。1個酶活力單位的定義：在50l反應體系中，1gDNA在推薦的反應緩沖液和溫度下反應1個小時，被完全酶切所需要的內切酶的量。過量的酶可縮短反應時間。但使用過多的酶將導致識別序列特異性下降。一般采用2-10倍的酶量。加入酶的總容積不能超過反應體系總容積的10%。否則甘油終濃度將達到5%以上，將抑制酶的活性。 2.酶切溫度及時間：根據產品說明確定最佳反應溫度。反應時間不宜太長，以免內切酶產生星活性。星活性（Star Activity）：是指限制性內切酶在

8、某些反應條件產生的識別并切割非特異序列位點的現(xiàn)象。其結果是酶切條帶增多。星活性除了與酶本身的性質有關外，與酶過量、甘油濃度過高，pH值不合適、離子濃度過低、酶切時間過長等有關。酶切時間比增加酶量更易產生星活性。 3.終止反應：可以通過以下3種方式終止酶切反應： 若DNA在酶切后不進行進一步的酶反應時，可加入EDTA至終濃度10mM，或加入0.1%SDS。EDTA對酶的滅活徹底，但EDTA存在將使連接反應變得極為困難。 若DNA在酶切后須進行下一步的酶反應，可將反應產物置65或80加熱20分鐘。但有些酶加熱滅活不徹底。 用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。4.酶切結果的鑒定 酶切完成后，取適量反應液進

9、行瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結果。 1.按順序，在1.5ml微量離心管中配制反應試劑： 10X Buffer（緩沖液）5l DNA (100ng/l)（質粒） 44l BamH I (15Units/l)0.5l Xho I (10Units/l)0.5l2.混勻試劑。將離心管置37水浴，反應1小時。三、三、實驗步驟微量移液槍將微量離心管置于適當支撐物上面（如插在泡沫塑料板上面）3. 瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段 制備1%瓊脂糖凝膠。 在每個酶切反應管中加入1/10體積10X上樣緩沖液，混勻。 將樣品平均加入2個加樣孔內，每個孔加樣27.5l。 135V衡壓電泳30-40分鐘。 在紫外燈下觀察酶切條

10、帶。 將酶切完全的質粒大片斷、PCR產物從凝膠中切割下來，裝入1.5ml微量離心管中。 置-20保存。 四、影響因素內切酶：內切酶：n不應混有其它雜蛋白特別是其它內切酶或外切酶的不應混有其它雜蛋白特別是其它內切酶或外切酶的污染；污染；n注意內切酶的識別位點及形成的粘性末端；注意內切酶的識別位點及形成的粘性末端；n內切酶的用量：根據內切酶單位和用量而定，內切酶的用量：根據內切酶單位和用量而定，通常通常 1u1u指在適當條件下，指在適當條件下，1 1小時內完全酶解小時內完全酶解ugug特定特定底物所需要的限制性內切酶量，使用中一般底物所需要的限制性內切酶量，使用中一般以以ug DNAug DNA對

11、對u u酶短時間為宜。酶短時間為宜。n同時內切酶體積不能超過反應體系，因內切同時內切酶體積不能超過反應體系，因內切酶中含甘油，體系中甘油超過會抑制內酶中含甘油，體系中甘油超過會抑制內切酶活力；切酶活力；n內切酶操作應在低溫下進行（冰上）；使用時防止內切酶操作應在低溫下進行（冰上）；使用時防止操作中對內切酶的污染。操作中對內切酶的污染。 n作為內切酶底物，應該具備一定的純度，其溶液中不作為內切酶底物，應該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、能含酚、氯仿、乙醚、SDSSDS、EDTAEDTA、高鹽濃度、酒精等，這、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內切酶的活力。些因素的

12、存在均不同程度影響限制性內切酶的活力。n這種抑制可通過：這種抑制可通過： 增加酶作用單位數(shù)（增加酶作用單位數(shù)（1020U/ug DNA1020U/ug DNA）、）、 增大反應體積以稀釋可能的抑制劑增大反應體積以稀釋可能的抑制劑 或延長反應時間加以克服?；蜓娱L反應時間加以克服。： n反應緩沖液主要由反應緩沖液主要由TrisTrisHClHCl、NaClNaCl、Mg2Mg2+ +組成，其中組成，其中Mg2Mg2+ +為內切酶輔基；為內切酶輔基；nTrisTrisHClHCl維持反應體系維持反應體系pHpH值在值在7.2-7.67.2-7.6之間；之間；nNaClNaCl濃度不同形成種級別的離子

13、強度：濃度不同形成種級別的離子強度： 低鹽（低鹽（10mM NaCl)10mM NaCl) 中鹽（中鹽（50mM NaCl50mM NaCl） 高鹽（高鹽（100mM NaCl100mM NaCl）n 不同的內切酶選擇特定的反應緩沖液。不同的內切酶選擇特定的反應緩沖液。反應緩沖液：反應緩沖液： n大多數(shù)限制酶反應溫度為大多數(shù)限制酶反應溫度為，如，如EcoR, Hind, EcoR, Hind, BamH, PstBamH, Pst等，也有如等，也有如BclBcl需在需在下進行反應，下進行反應，n反應時間根據酶的單位與用量之比來定，原則反應時間根據酶的單位與用量之比來定，原則是酶：是酶：=：n1

14、212小時即可充分酶解。小時即可充分酶解。酶解溫度與時間：酶解溫度與時間：五、酶切結果 1 2 31 1泳道泳道 makermaker2 2泳道泳道 質粒質粒DNADNA3 3泳道泳道 酶切產物酶切產物 從電泳結果可以看出，第三泳道出現(xiàn)兩個區(qū)帶，第二泳道只有一個比較寬大的區(qū)帶，也就是說，限制性核酸內切酶將質粒切割成了性質不同的兩部分，說明了限制性核酸內切酶對DNA的切割活性。六、分析討論一、如果DNADNA完全沒有被內切酶切割？完全沒有被內切酶切割？原因原因1. 1.內切酶失活內切酶失活2.2.DNADNA不純，含有不純，含有SDSSDS，酚，酚，EDTAEDTA等內切酶抑制因子等內切酶抑制因

15、子3.3.條件不適（試劑、溫度）條件不適（試劑、溫度）4.4.DNADNA酶切位點上的堿基被酶切位點上的堿基被甲基化甲基化5.5.DNADNA酶切位點上沒有甲基酶切位點上沒有甲基化（如化（如Dpn IDpn I）6.6.DNADNA位點上存在其它修飾位點上存在其它修飾7.7.DNADNA不存在該酶識別順序不存在該酶識別順序對對策策1. 1.標準底物檢測酶活性標準底物檢測酶活性2.2.將將DNADNA過柱純化，乙醇沉淀過柱純化，乙醇沉淀DNADNA3.3.檢查反應系統(tǒng)是否最佳檢查反應系統(tǒng)是否最佳4.4.換用對換用對DNADNA甲基化不敏感的同裂甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質粒酶酶解，重新將質

16、粒DNADNA轉化至轉化至dcm-dcm-，dam-dam-基因型的細菌菌株基因型的細菌菌株5.5.換用不同切割非甲基化位點的同裂換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化酶消化DNADNA（如（如San3A ISan3A I代替代替Dpn Dpn I) I)，重新將質粒轉至，重新將質粒轉至dcm+ dam+dcm+ dam+菌菌株中擴增株中擴增6.6.將將DNADNA底物與底物與DANDAN混勻進行切混勻進行切割驗證割驗證7.7.換用其它的酶切割換用其它的酶切割DNADNA或過量酶或過量酶消化進行驗證消化進行驗證二、如果DNA切割不完全？原因原因1. 1.內切酶活性下降內切酶活性下降2.2.內切酶

17、稀釋不正確內切酶稀釋不正確3.3.DNADNA不純，反應條件不佳不純，反應條件不佳4.4.內切酶識別的內切酶識別的DNADNA位點上的堿位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾基被甲基化或存在其它修飾5.5.部分部分DNADNA溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上6.6.內切酶溶液粘度大，取樣不準內切酶溶液粘度大，取樣不準7.7.酶切后酶切后DNADNA粘末端退火粘末端退火8.8.由于反應溶液、溫度、強烈振由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性蕩使內切酶變性9.9.過度稀釋使酶活性降低過度稀釋使酶活性降低10.10.反應條件不適反應條件不適11.11.識別位點兩側插入了可影響酶識別位點兩側插入了可影響酶切

18、效率的核酸順序切效率的核酸順序對對策策1. 1.用用5-105-10倍量過量消化倍量過量消化2.2.用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶酶3.3.同上同上4.4.同上同上5.5.反應前離心數(shù)秒反應前離心數(shù)秒6.6.將內切酶稀釋，增大取樣體積將內切酶稀釋，增大取樣體積7.7.電泳前將樣品置電泳前將樣品置6565保溫保溫5-105-10分鐘，取出后置冰浴驟冷分鐘，取出后置冰浴驟冷8.8.使用標準反應緩沖液及溫度，使用標準反應緩沖液及溫度，避免強烈振蕩避免強烈振蕩9.9.適當稀釋酶液，反應液稀釋的適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏酶不能貯藏10.10.使用最佳反應體系使用最佳反應體系11.11.加大酶量加大酶量5-