1、質(zhì)粒質(zhì)粒RopdimerPRNAIIRNA IIa、在復(fù)制起點(diǎn)處，、在復(fù)制起點(diǎn)處， RNA II（長(zhǎng)（長(zhǎng)555個(gè)堿基）與質(zhì)粒個(gè)堿基）與質(zhì)粒DNA形成形成RNA-DNA復(fù)合物，復(fù)合物，RNA酶酶H可降解可降解RNA II ，露出，露出3自由羥基，自由羥基，質(zhì)粒復(fù)制起始。在該區(qū)域還能反向轉(zhuǎn)錄形成質(zhì)粒復(fù)制起始。在該區(qū)域還能反向轉(zhuǎn)錄形成RNA I，I和和II為互為互補(bǔ)的補(bǔ)的RNA。RopdimerPRNAIIRNA IIa) 復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域含有復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域含有37拷貝的長(zhǎng)度為拷貝的長(zhǎng)度為1722bp的的重復(fù)區(qū)域，重復(fù)區(qū)域，R1、R2、R3等。等。b)復(fù)制原點(diǎn)附近有一個(gè)編碼基因復(fù)制原點(diǎn)附近有一個(gè)編碼基因r

2、epA,編碼編碼RepA蛋白。蛋白。 RepA是雙功能的蛋白：是雙功能的蛋白： 與復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域的重復(fù)序列結(jié)合，起始與復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域的重復(fù)序列結(jié)合，起始DNA的合成；與自的合成；與自身基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制自身的轉(zhuǎn)錄。身基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制自身的轉(zhuǎn)錄。R7268ApRR1 drd 19ApR CmR SmRSuR KmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApR TcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApR TcR78pMB1(b)BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTAC

3、CCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII無啟動(dòng)子序列無啟動(dòng)子序列報(bào)告報(bào)告基因基因MCS復(fù)制原點(diǎn)選擇標(biāo)記高效啟動(dòng)子高效啟動(dòng)子終止子序列終止子序列核糖體核糖體結(jié)合位結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3） 等AproripGEM-3Z2743 bplacZPT7MCSPSP6超螺旋超螺旋 DNA松弛cccDNA開環(huán)DNA核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶DNA連接

4、酶連接酶核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶DNA促旋酶促旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶Upper band containing chromosomal DNA and open plasmid circlesLower band of covalently closed circles plasmid DNAEthidium bromide (EB)電泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ渾濁清亮（左右臂連接） （三段自身連接） （插入片段） 根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來進(jìn)行重組子的篩選根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來進(jìn)行重組子的篩選 cIEcoR I LA 32.7RA10.6gt 10 lac ZLA 1

5、9.9RA21.9EcoR ICharon 16ALac Z EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40Lyse, mixAdd ATP and concatemerized DNAMature phage particlesRF DNAM13mp系列載體系列載體polylinkerlacZIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體系列載體polylinkerlacZBlue-white selection pHC796.4 kb

6、柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體pHC79圖圖由由pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒DNA與與噬菌體噬菌體DNA的的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成列構(gòu)成+Cre recombinase protein circularizes injected DNA at the lox P sites. DNA-replicates using plasmid replicon, Plasmid copy number is increased by induction of P1 lytic replicon.Pac extract cleaves at pac site and inserts

7、 DNA into p1 heads. Tails are attachedAllow phage to adsorb to host strain and inject DNA into cre+ host cell.正常酵母人工染色體含有：正常酵母人工染色體含有：* 四膜蟲端粒（四膜蟲端粒（tel)* 酵母自主復(fù)制序列（酵母自主復(fù)制序列（ARS)* 酵母著絲點(diǎn)酵母著絲點(diǎn) (CEN)* 酵母的選擇標(biāo)記酵母的選擇標(biāo)記 (TRP1、URA1)YAC載體載體（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)已知有兩種不同的限制酶都可產(chǎn)生粘性末端：已知有兩種不同的限制酶都可產(chǎn)生粘性末端：5-P 端突出：端突出：3-OH 端突

8、出：端突出：Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5同裂酶（isoschizomers） 有一些來源不同的限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切有一些來源不同的限制性內(nèi)切酶能識(shí)別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。5TCGATCGA3 5TCGA*TCGA*35AGCTAGCT3 5 A*GCTA*GCT3Taq ITaq IDpn I5ATCGAT3Cla I5GA*TCGAT35ATCGA*TC3o4）部分酶對(duì)其識(shí)別序列內(nèi)的堿基是否甲基化， 不影響切割5(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)

9、3Cla I二、連接酶二、連接酶1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間鏈之間形成形成3 ， 5磷酸二酯鍵的酶磷酸二酯鍵的酶5末端形末端形成成DNA腺腺苷酸復(fù)合物苷酸復(fù)合物OH3 5PGGTAC-OH P-CC-P HO-CATGG5 33 5GG-OH P-CCCCATGG5 33 5GGTACCCCATGG5 33 5大片段（ Klenow片段）：53 的聚合酶活性，3 5外切核酸酶小片段lDNA聚合酶53OH+ Mg2+ + dATP+TdT53AAAAAAAA53OH53AAAAAAAA+ Co2+ + dATP+TdT53OH+ Co2+ + dATP+Td

10、T53AAAAAAAAA3突出端平端3凹端雙酶切反應(yīng)的原則雙酶切反應(yīng)的原則A、鹽濃度要求相似的內(nèi)切酶可在一個(gè)反、鹽濃度要求相似的內(nèi)切酶可在一個(gè)反應(yīng)體系中做雙酶切反應(yīng)應(yīng)體系中做雙酶切反應(yīng)B、先做低鹽反應(yīng)酶切再做高鹽反應(yīng)的酶、先做低鹽反應(yīng)酶切再做高鹽反應(yīng)的酶切切C、考慮雙酶切位點(diǎn)的核苷酸排列、考慮雙酶切位點(diǎn)的核苷酸排列5GAATTC3EcoR I低鹽、高pH值、過量甘油5AAATTC35GAGTTC31、互補(bǔ)黏性末端之間的連接、互補(bǔ)黏性末端之間的連接n同一限制酶切割位點(diǎn)連接：同一限制酶切割位點(diǎn)連接： 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片片段具有完全相同的末端。只

11、要酶切割段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后產(chǎn)生單鏈突出（后產(chǎn)生單鏈突出（5突出及突出及3突突出）的粘性末端，同時(shí)酶切位點(diǎn)附近的出）的粘性末端，同時(shí)酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接，那么，當(dāng)這序列不影響連接，那么，當(dāng)這樣的兩個(gè)樣的兩個(gè)DNA片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組DNA分子。具有兩個(gè)插入方向分子。具有兩個(gè)插入方向n 兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接：兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)連接： 只可一種方向插入只可一種方向插入n 同尾酶切割位點(diǎn)連接：發(fā)生酶切

12、口的焊死作用同尾酶切割位點(diǎn)連接：發(fā)生酶切口的焊死作用五、五、DNA分子重組的方分子重組的方法法DNA 接頭接頭dATPdTTP同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端從生物秀網(wǎng)站下載外膜與內(nèi)膜外膜與內(nèi)膜間的部分核間的部分核酸酶離開酸酶離開 細(xì)胞膨脹細(xì)胞膨脹 細(xì)胞膜磷酯層形成液晶細(xì)胞膜磷酯層形成液晶感受態(tài)感受態(tài)加入加入DNA羥基磷酸鈣羥基磷酸鈣-DNA復(fù)合物復(fù)合物核酸酶不能降解核酸酶不能降解42處理處理膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透生變化，通透性增加，性增加，DNA進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞低滲低滲CaCl2溶液溶液供體菌供體菌(待轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒待轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒的菌株），不能在最小培養(yǎng)的菌株），

13、不能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但抗生素基中生長(zhǎng)，但抗生素XR輔助菌輔助菌(含輔助質(zhì)粒的菌含輔助質(zhì)粒的菌株），株），不能在最小培養(yǎng)不能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但抗生素基中生長(zhǎng)，但抗生素YR受體菌受體菌, 能在最小能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)在無抗生素在無抗生素的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)一混合培養(yǎng)一段時(shí)間后段時(shí)間后含有含有X+Y的最的最小培養(yǎng)基小培養(yǎng)基BamH IBamH IPst IPst I含有？抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)含有？抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正選擇只能篩選轉(zhuǎn)化子只能篩選轉(zhuǎn)化子BamH IBamH I含有？抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)BamH IBamH I含有氨芐抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)BamH IBamH

14、I篩選重組子篩選重組子含有氨芐抗生素的培養(yǎng)基氨芐四環(huán)素的培養(yǎng)基？lac Z: -gallactosidase (-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lac Y: lactose permease（半乳糖苷透性酶，運(yùn)送乳糖透過細(xì)菌的細(xì)胞壁)lac A: transacetylase（半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)lac I: 乳糖阻遏蛋白基因Plac :乳糖代謝結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子PI : 阻遏蛋白基因的啟動(dòng)子CAP：代謝激活蛋白結(jié)合位點(diǎn) 阻遏蛋白四聚體不僅能被別乳糖結(jié)合，也能被與別乳阻遏蛋白四聚體不僅能被別乳糖結(jié)合，

15、也能被與別乳糖結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)如糖結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)如IPTG(異丙基異丙基-D-硫代半乳糖）結(jié)合，硫代半乳糖）結(jié)合，這種這種能高效誘導(dǎo)酶的合成，但又不被所誘導(dǎo)的酶分解的分能高效誘導(dǎo)酶的合成，但又不被所誘導(dǎo)的酶分解的分子，稱為子，稱為安慰性誘導(dǎo)物安慰性誘導(dǎo)物載體載體PucPuc系列（系列（PUC18/19PUC18/19）帶有帶有E.coli DNAE.coli DNA的短區(qū)段，含：的短區(qū)段，含： (1) LaczM15(1) LaczM15編碼編碼半糖苷酶半糖苷酶N N端的端的 146146個(gè)個(gè)AAAA信息也稱信息也稱肽；肽； (2)(2)編碼區(qū)插入一個(gè)編碼區(qū)插入一個(gè)MCSMCS并不破壞閱讀框，少

16、數(shù)幾個(gè)并不破壞閱讀框，少數(shù)幾個(gè)AAAA插入插入到該酶的到該酶的N N端而不影響其功能；端而不影響其功能； (3)Plac(3)Plac可以啟動(dòng)可以啟動(dòng)LaczLacz的的 轉(zhuǎn)錄，表達(dá)，但受阻轉(zhuǎn)錄，表達(dá)，但受阻pr.pr.阻遏，阻遏，IPTGIPTG（異丙基硫代（異丙基硫代半乳糖苷）能夠去阻遏。半乳糖苷）能夠去阻遏。JM103JM103受體菌含受體菌含lacz(c)lacz(c)編碼編碼半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 C C端部分端部分互補(bǔ)互補(bǔ) 當(dāng)載體轉(zhuǎn)入當(dāng)載體轉(zhuǎn)入JM103 lacz(n)與與lacz(c) lacz(c) 互補(bǔ)，編碼互補(bǔ)，編碼具有活性酶具有活性酶prpr使底物使底物X-galX-g

17、al生色（生色（5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚半乳糖苷半乳糖苷產(chǎn)生蘭菌落）。產(chǎn)生蘭菌落）。當(dāng)當(dāng)MCSMCS插入外源插入外源genegene片斷時(shí)，幾乎無一例外產(chǎn)生無片斷時(shí)，幾乎無一例外產(chǎn)生無互補(bǔ)能互補(bǔ)能力的力的 氨基酸片段（插入酶失落）導(dǎo)致白菌落產(chǎn)生。氨基酸片段（插入酶失落）導(dǎo)致白菌落產(chǎn)生。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM 103外源基因片段插入外源基因片段插入 白菌落白菌落IPTGlacz(c) X-gal藍(lán)菌落藍(lán)菌落-半乳糖苷酶半乳糖苷酶圖圖8-5 -互補(bǔ)互補(bǔ)a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO調(diào)控蛋白調(diào)控蛋白-肽段肽段分解分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑IPTG-半乳糖苷酶