1、第二節(jié)第二節(jié) 分配色譜分配色譜一、基本原理一、基本原理1、吸附色譜的局限性、吸附色譜的局限性（1）吸附色譜不適合于分離強極性的親水性物）吸附色譜不適合于分離強極性的親水性物質(zhì)（成分）；質(zhì)（成分）；（2）吸附劑的含水量對吸附劑的吸附能力影響）吸附劑的含水量對吸附劑的吸附能力影響較大，常使結(jié)果重現(xiàn)性較差；較大，常使結(jié)果重現(xiàn)性較差；（3）易出現(xiàn)拖尾峰。）易出現(xiàn)拖尾峰。l 2、分配色譜原理、分配色譜原理（1）固定相為液體）固定相為液體l將某種溶劑涂布在吸附劑顆粒表面或紙纖維上，形成一層液膜，稱將某種溶劑涂布在吸附劑顆粒表面或紙纖維上，形成一層液膜，稱為為固定相固定相。l吸附劑顆粒表面或紙纖維叫吸附劑顆

2、粒表面或紙纖維叫載體或擔體載體或擔體。l根據(jù)組分在兩相中的根據(jù)組分在兩相中的溶解度不同溶解度不同而分離。而分離。（2）“相似相溶相似相溶”原則原則l極性物質(zhì)在極性溶劑中溶解度大，極性物質(zhì)在極性溶劑中溶解度大，K大；大；l非極性物質(zhì)在非極性溶劑中溶解度大，非極性物質(zhì)在非極性溶劑中溶解度大，K大。大。（3）分配定律與分配等溫線）分配定律與分配等溫線（4）分配色譜的特點：）分配色譜的特點：la、重現(xiàn)性、重現(xiàn)性 lb、峰對稱、峰對稱lc、無強烈滯留現(xiàn)象、無強烈滯留現(xiàn)象.l 幾乎適用于各種類型的化合物，特別適宜于親水性物質(zhì)，如極性幾乎適用于各種類型的化合物，特別適宜于親水性物質(zhì)，如極性較大的生物堿、苷類

3、、有機酸、糖類及氨基酸的衍生物等。較大的生物堿、苷類、有機酸、糖類及氨基酸的衍生物等。二、載體二、載體l只起負載固定相的作用。只起負載固定相的作用。l要求：惰性、無吸附能力、純凈、顆粒要求：惰性、無吸附能力、純凈、顆粒均勻。均勻。l種類種類 1）硅膠：重現(xiàn)性差）硅膠：重現(xiàn)性差 2）硅藻土：應用最多）硅藻土：應用最多 3）纖維素：紙色譜）纖維素：紙色譜三、固定相和流動相的選擇三、固定相和流動相的選擇l 正相分配色譜：正相分配色譜：固定相的極性固定相的極性大于大于流動相的極流動相的極性；性；固定相：水、緩沖溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；固定相：水、緩沖溶液、稀硫酸、甲醇、丙二醇等；按一定的比例與載

4、體混勻后填裝于色譜柱。按一定的比例與載體混勻后填裝于色譜柱。流動相：石油醚等流動相：石油醚等洗脫順序洗脫順序:極性大極性大的組分的組分保留作用強保留作用強；極性?。粯O性小的組分保留作用弱的組分保留作用弱 l反相分配色譜反相分配色譜：固定相的極性：固定相的極性小于小于流動相流動相的極性。的極性。固定液：硅油、液體石蠟等極性較小的有機溶劑。固定液：硅油、液體石蠟等極性較小的有機溶劑。流動相：水、各種水溶液（酸、堿、鹽及緩沖流動相：水、各種水溶液（酸、堿、鹽及緩沖液）、與水混合的有機溶劑。液）、與水混合的有機溶劑。洗脫順序洗脫順序:極性小極性小的組分的組分保留作用強保留作用強；極性大的；極性大的組分

5、保留作用弱組分保留作用弱四、分配色譜操作注意事項1、兩相溶劑的處理、兩相溶劑的處理2、上樣量與樣品前處理。、上樣量與樣品前處理。3、柱色譜、柱色譜4、紙色譜紙色譜第三節(jié) 離子交換色譜法(ion exchange chromatography)一、基本原理一、基本原理1、離子交換劑與離子交換過程、離子交換劑與離子交換過程 為一種固體狀可在水溶液中浸潤和溶脹的多孔顆為一種固體狀可在水溶液中浸潤和溶脹的多孔顆粒，其表面有許多可電離的基團，在水中電離時，粒，其表面有許多可電離的基團，在水中電離時，有一種離子可在水中自由移動，而另一種則在固有一種離子可在水中自由移動，而另一種則在固定相上不能自由移動。定

6、相上不能自由移動。 可自由移動的離子可以被其它同類離子置換，即可自由移動的離子可以被其它同類離子置換，即離子交換。離子交換。 水溶液中（流動相中）的各種離子，可與離子水溶液中（流動相中）的各種離子，可與離子交換樹脂上固定的離子基團結(jié)合，使原來與其交換樹脂上固定的離子基團結(jié)合，使原來與其結(jié)合的離子被置換，進入流動相而發(fā)生置換。結(jié)合的離子被置換，進入流動相而發(fā)生置換。 帶負電的交換基團（固定的離子基團，如磺酸基、羧帶負電的交換基團（固定的離子基團，如磺酸基、羧酸基）：用于陽離子分離；酸基）：用于陽離子分離； 帶正電的交換基團（固定的離子基團，如季胺鹽）：帶正電的交換基團（固定的離子基團，如季胺鹽）

7、：用于陰離子分離。用于陰離子分離。 2、分離機理（1）不同的離子與交換樹脂的結(jié)合力不同，從而固定）不同的離子與交換樹脂的結(jié)合力不同，從而固定相對它的保留能力不同，從而造成差速遷移。相對它的保留能力不同，從而造成差速遷移。（2）離子交換平衡：）離子交換平衡： NaARANaRKANaRNaAR K 為選擇性系數(shù)為選擇性系數(shù) （交換平衡常數(shù)）（交換平衡常數(shù)）二、離子交換樹脂1、離子交換樹脂的構(gòu)成離子交換樹脂的構(gòu)成由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不溶于水由苯乙稀和二乙烯基苯聚合而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不溶于水和有機溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定。和有機溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定。 2、離子交換樹脂的類型、離子交換樹脂的類型（1

8、）陽離子交換樹脂）陽離子交換樹脂 可交換的離子為陽離子?？山粨Q的離子為陽離子。l氫型、鈉型氫型、鈉型 l強酸型、弱酸型、中強酸型（強酸型、弱酸型、中強酸型（COOH、PO3H、SH） 例如：磺酸型例如：磺酸型 R-SO3H+ (pH范圍寬范圍寬) * 應注意應注意pH范圍，否則交換容量急劇下降。范圍，否則交換容量急劇下降。（2）陰離子交換樹脂）陰離子交換樹脂 可交換的離子為陰離子?？山粨Q的離子為陰離子。l按不同堿性分：按不同堿性分： 強堿型（季胺基團）強堿型（季胺基團）NR3+ (pH11) NH2, NHR,NR2等等 (pH B3+ C2+ D+大分子量的有機離子大分子量的有機離子,有較高

9、的親和力有較高的親和力 四、流動相1、組成：一般為鹽類的緩沖水溶液（有一定、組成：一般為鹽類的緩沖水溶液（有一定的的pHpH值）。值）。2 2、對分離的影響、對分離的影響2、對分離的影響對分離的影響流動相主要影響組分離子和交換基團形成離子對流動相主要影響組分離子和交換基團形成離子對的過程的過程 pH對弱酸、弱堿的影響對弱酸、弱堿的影響l影響其離解平衡，即控制了組分形成離子的程影響其離解平衡，即控制了組分形成離子的程度：度： 離子離子組分組分，則，則K； 離子離子組分組分，則，則K l不同離子交換劑的不同離子交換劑的pH適用范圍：適用范圍：強酸型：較寬強酸型：較寬; 強堿型：強堿型：PH6; 弱

10、堿型：弱堿型：PH2000）一、基本原理1、分離機理、分離機理l（1）前三種是親和力不同而分離；）前三種是親和力不同而分離；l（2）凝膠色譜中組分與固定相之間無作用力，只是根據(jù)）凝膠色譜中組分與固定相之間無作用力，只是根據(jù)分子量大小來分離；分子量大小來分離；l（3）凝膠）凝膠 有一定的孔徑分布范圍的多孔物質(zhì)。組分進有一定的孔徑分布范圍的多孔物質(zhì)。組分進入柱內(nèi)后，全向固定相的孔中擴散，保留程度取決于孔和入柱內(nèi)后，全向固定相的孔中擴散，保留程度取決于孔和組分分子的大小。組分分子的大小。 小分子小分子:將全部滲入細孔中將全部滲入細孔中,在流經(jīng)柱時在流經(jīng)柱時,經(jīng)歷的路程最長經(jīng)歷的路程最長. 中等大小分

11、子中等大小分子:滲入部分較大的孔隙滲入部分較大的孔隙,而被較小的孔隙排斥而被較小的孔隙排斥,經(jīng)歷的路程居中經(jīng)歷的路程居中. 大分子大分子:完全被排斥在空隙外完全被排斥在空隙外,經(jīng)歷的路程最短經(jīng)歷的路程最短.l所以洗脫次序僅是分子大小所以洗脫次序僅是分子大小(分子量分子量)的函數(shù)。的函數(shù)。l分子大小受分子量分子大小受分子量,分子幾何形狀（環(huán)球形、分子幾何形狀（環(huán)球形、螺旋形或棒形）組分分子間的締合程度、組螺旋形或棒形）組分分子間的締合程度、組分與流動相分子間的締合程度有關(guān)。分與流動相分子間的締合程度有關(guān)。Size Exclusion ChromatographyGel.mov2、分配系數(shù)和保留值

12、、分配系數(shù)和保留值(1) 分配系數(shù)分配系數(shù)Kl組分進入柱子，從高濃度的流動相中向固定相孔隙內(nèi)擴組分進入柱子，從高濃度的流動相中向固定相孔隙內(nèi)擴散，擴散平衡時散，擴散平衡時la、小分子平衡時，一半組分在孔隙內(nèi)，一半組分在孔、小分子平衡時，一半組分在孔隙內(nèi)，一半組分在孔隙外。隙外。 CS=Cm K=1 lb、大分子（直徑大于固定相孔徑時），被全部排斥在、大分子（直徑大于固定相孔徑時），被全部排斥在固定相孔隙之外固定相孔隙之外 CS=0 K=0lc、中等大小分子，直徑介于以上兩種極限之間，、中等大小分子，直徑介于以上兩種極限之間， 0K1l所以在凝膠色譜中所以在凝膠色譜中 0K1smXXmsCCK

13、（2）保留值）保留值l保留方程保留方程 VR = Vm + KVS 在凝膠色譜中在凝膠色譜中 Vm：外水體積（：外水體積（V0） VS：內(nèi)水體積（：內(nèi)水體積（Vi）l當當 K = 1 時，時，VR Vm VSV0Vi K = 0 時，時，VR Vm V0l所以，所有組分均在所以，所有組分均在 （Vi+V0） 體積內(nèi)流出。體積內(nèi)流出。二、凝膠類型 （自學）1、葡聚糖凝膠2、聚丙烯酰胺凝膠3、瓊脂糖凝膠4、多孔玻璃凝膠 14 用于親水性樣品的分離5、聚苯乙烯凝膠（非水溶液樣品親脂性）分子量較正曲線分子量較正曲線將分子量不同的組分混合物注將分子量不同的組分混合物注入柱子，經(jīng)分離后，分別測得入柱子，經(jīng)

14、分離后，分別測得它們的保留體積，以分子量對它們的保留體積，以分子量對保留體積作圖，得一曲線，稱保留體積作圖，得一曲線，稱分子量校正曲線。分子量校正曲線。圖中，圖中，A、B兩點反映了該固定兩點反映了該固定相能夠分離的組分分子量的上相能夠分離的組分分子量的上限限(排斥極限排斥極限)、下限、下限(全滲透極全滲透極限限)，只有分子量在，只有分子量在A、B對應量對應量之間的組分才能被分離。之間的組分才能被分離。1、凝膠的選擇（主要通過選擇凝膠來改善分離）、凝膠的選擇（主要通過選擇凝膠來改善分離）2、凝膠的溶脹、凝膠的溶脹干凝膠干凝膠+10倍吸水量的洗脫劑中，緩慢攪拌；倍吸水量的洗脫劑中，緩慢攪拌；注意：時間足夠長，不易過稀。注意：時間足夠長，不易過稀。3、裝柱：不應有氣泡。、裝柱：不應有氣泡。柱長柱長100cm4、樣品的制備、樣品的制備組別分離（粗分）：上