1、影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素影響光學(xué)顯微鏡成像的若干因素 夫瑯和費(fèi)圓孔衍射 艾里斑 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) 瑞利判據(jù) 夫瑯和費(fèi)圓孔衍射 光波繞過(guò)障礙物傳播的現(xiàn)象稱為光的衍射。衍射后所形成的明暗相間的圖樣稱為衍射圖樣 在夫瑯和費(fèi)圓孔衍射中，光源、觀察屏與障礙物之間的距離都是無(wú)限遠(yuǎn)，障礙物為一直徑為R的圓孔（顯微鏡的物鏡可與該障礙物相當(dāng)）夫瑯和費(fèi)衍射圖樣的觀察 利用兩塊會(huì)聚透鏡，一塊放在障礙物前，將點(diǎn)光源發(fā)出的光變?yōu)槠叫泄?，另一塊放在障礙物后，使經(jīng)過(guò)障礙物后的衍射光在透鏡的焦平面上成像艾里斑 由圓孔衍射圖樣的第一暗環(huán)包圍的中央亮斑稱為艾里斑（Airy d

2、isc）。理論計(jì)算表明，艾里斑的光強(qiáng)占整個(gè)入射光強(qiáng)的84%。艾里斑的半徑為 其中f是透鏡L2的焦距， 是入射光的波長(zhǎng)，R是圓孔的半徑?？梢钥吹?，孔徑R越小，或者波長(zhǎng)越大，衍射現(xiàn)象越明顯R2f22. 1r 圓孔衍射現(xiàn)象是顯微鏡成像過(guò)程中不可避免的現(xiàn)象，它對(duì)顯微鏡的分辨率將產(chǎn)生重大的影響 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) 從理想情況看，點(diǎn)光源通過(guò)一個(gè)無(wú)缺陷的光學(xué)系統(tǒng)后應(yīng)在像平面獲得對(duì)應(yīng)的點(diǎn)像，但是由于圓孔衍射現(xiàn)象的存在，點(diǎn)光源在焦平面上的成像實(shí)際為一個(gè)光斑。 為了能夠?qū)?shí)際光學(xué)系統(tǒng)的性質(zhì)做出正確描述，將一個(gè)直徑為無(wú)限小的理論點(diǎn)光源通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)后的成像性質(zhì)用點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（point spread functionpoint

3、 spread function，PSFPSF）表示點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) 一般而言，點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)是不可能精確得到的。由于光學(xué)系統(tǒng)的聚焦不良、樣品與光學(xué)系統(tǒng)之間的相對(duì)運(yùn)動(dòng)等引起的圖像模糊是影響系統(tǒng)成像質(zhì)量的主要原因，因此根據(jù)圖像降質(zhì)（退化）物理過(guò)程的先驗(yàn)知識(shí)，可以估計(jì)出成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) 因?yàn)橐粋€(gè)成像系統(tǒng)對(duì)函數(shù)的沖擊響應(yīng)能夠反映該系統(tǒng)具有的衍射、像差以及一切造成光能量擴(kuò)散的固有性質(zhì)，所以輸入為函數(shù)時(shí)系統(tǒng)的輸出函數(shù)即為成像系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)瑞利判據(jù) 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的分辨率有著重要的影響 利用顯微鏡觀察樣品，其圖像可以看成有許多不同亮度、不同位置物點(diǎn)的像所組成。每個(gè)物點(diǎn)所成的像實(shí)際上是一定大小的

4、艾里斑，物點(diǎn)靠得太近，物點(diǎn)所成的像彼此重疊，樣品的細(xì)節(jié)變得模糊不清 衍射現(xiàn)象限制了光學(xué)系統(tǒng)分辨細(xì)節(jié)的能力瑞利判據(jù) 物理學(xué)家瑞利（Rayleign）指出，A衍射圖樣的中央最大光強(qiáng)度與B衍射圖樣的第一最小光強(qiáng)度重合所確定的兩物點(diǎn)間的距離就是光學(xué)系統(tǒng)所能分辨的兩物點(diǎn)間的極限距離。稱這個(gè)極限距離為瑞利判據(jù) A.N61. 0Z瑞利判據(jù)瑞利判據(jù) 隨著兩物點(diǎn)距離的縮小，光學(xué)系統(tǒng)由于衍射現(xiàn)象以及總光強(qiáng)的疊加最終不能分辨出相應(yīng)的物點(diǎn)光學(xué)顯微鏡成像的數(shù)學(xué)模型將顯微鏡中圖像的形成看作是一個(gè)線性過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，樣品上的每一點(diǎn)與物鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行卷積，從而獲得一幅觀察圖像。 顯微鏡成像的數(shù)字模型 其中 表示觀察圖

5、像， 表示理想圖像， 表示顯微鏡系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。 )z, y, x( s)z, y, x(o)z, y, x( i) z , y, x( i)z, y, x(o)z, y, x( s圖像復(fù)原 由觀察圖像復(fù)原理想圖像，在數(shù)學(xué)上來(lái)說(shuō)是一個(gè)逆向問(wèn)題。如果顯微鏡系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)PSF是已知的話，則可以通過(guò)逆向運(yùn)算，復(fù)原理想圖像去卷積 去模糊法（deblurring）最近鄰域法 圖像復(fù)原法（image restoration）約束迭代法反向?yàn)V波法 去卷積圖像約束迭代法（constrained iterative） 首先實(shí)現(xiàn)對(duì)理想圖像的最初估計(jì)，一般是原始圖像自身。用估計(jì)圖像和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行卷積，獲得模糊的估計(jì)圖像 將該圖像與最初的原始圖像進(jìn)行比較。比較結(jié)果用于確定誤差尺度，它將描述模糊的估計(jì)圖像與原始圖像的相似程度 利用誤差尺度，在減少誤差的前提下修改估計(jì)圖像。約束迭代法（constrained iterative） 用修改后的估計(jì)圖像與點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行卷積，計(jì)算新的誤差尺度 隨著算法的進(jìn)行，每一次確定的誤差標(biāo)準(zhǔn)并非最小，進(jìn)行新的估計(jì)圖像的再模糊過(guò)程，重新計(jì)算誤差尺度 整個(gè)迭代