1、第九章 原生質(zhì)體培養(yǎng) 與體細胞雜交第一節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)一、 原生質(zhì)體概述4原生質(zhì)體(protoplast)脫去細胞壁、裸露的植脫去細胞壁、裸露的植物細胞。原生質(zhì)體是為物細胞。原生質(zhì)體是為質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。（一）定 義5原生質(zhì)體原生質(zhì)體無細胞壁障礙無細胞壁障礙，便于，便于進行有關(guān)遺傳操作；在誘導(dǎo)條進行有關(guān)遺傳操作；在誘導(dǎo)條件下易發(fā)生件下易發(fā)生融合，形成雜種細融合，形成雜種細胞胞；具全能性具全能性, ,能再生細胞壁能再生細胞壁, ,能進能進行植物細胞的各項生理活動；行植物細胞的各項生理活動； 穩(wěn)定性較差穩(wěn)定性較差，滲透壓穩(wěn)定劑。，滲透壓穩(wěn)定劑。（二）原生質(zhì)體特點二、 原生

2、質(zhì)體的分離與純化7葉肉細胞葉肉細胞是分離原生質(zhì)體的最好的細胞材料。是分離原生質(zhì)體的最好的細胞材料。1 1、葉肉細胞排列疏松，易于分離；、葉肉細胞排列疏松，易于分離；2 2、含有葉綠體，為雜種細胞提供天然的選擇標記；、含有葉綠體，為雜種細胞提供天然的選擇標記；（一）原生質(zhì)體材料的來源適宜于分離原生質(zhì)適宜于分離原生質(zhì)體的細胞培養(yǎng)體系：體的細胞培養(yǎng)體系：結(jié)構(gòu)疏松；處于對結(jié)構(gòu)疏松；處于對數(shù)生長期數(shù)生長期（二）材料的預(yù)處理n作用：改變細胞和細胞壁的生理狀態(tài)；增加細胞膜的強度；減輕酶溶液中雜酶對原生質(zhì)膜的損傷。n方法：暗處理；預(yù)培養(yǎng)；預(yù)質(zhì)壁分離；89（三）原生質(zhì)體的分離方法 1、機械法：、機械法：原生質(zhì)體

3、得率原生質(zhì)體得率極低，難以大極低，難以大量制備量制備2、酶法：、酶法：大量獲得植物大量獲得植物原生質(zhì)體的有原生質(zhì)體的有效方法效方法101 1、機械分離法、機械分離法：先將細胞放在高滲糖溶液中預(yù)先將細胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細胞發(fā)生處理，待細胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用成球形后，再用機械法切機械法切/ /磨碎磨碎組織，從傷口處組織，從傷口處可釋放出原生質(zhì)體?？舍尫懦鲈|(zhì)體。11Mechanical method of protoplast isolationn優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。壞作

4、用。n缺點：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少。缺點：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少。122 2、酶解分離法、酶解分離法： 指將材料放入能降解細指將材料放入能降解細胞壁的混合胞壁的混合等滲酶液等滲酶液中保溫一定時間，在酶中保溫一定時間，在酶液的作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量液的作用下，細胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。有活力的原生質(zhì)體的方法。13植物細胞壁的主要成分是：纖維素，占細胞壁干重的25至50不等；半纖維素，平均約占細胞壁干重的53左右；果膠質(zhì)，一般占細胞壁的5。分離原生質(zhì)體最常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶。14A. A. 纖維素酶纖維素酶，如，如Ono

5、zuka R-10Onozuka R-10及及RSRS，國內(nèi)常用的為，國內(nèi)常用的為EA3-EA3-867867，其中含少量果膠酶，其中含少量果膠酶，0.5-2.0 ；B.B.半纖維素酶半纖維素酶，如，如Rhozyme HP150Rhozyme HP150，用于懸浮細胞、豆，用于懸浮細胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生質(zhì)體的分離科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生質(zhì)體的分離; ;C.C.果膠酶果膠酶，如，如Macerozyme R-10 Macerozyme R-10 又叫離析酶，主要含果又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2 2，作用，作

6、用時間長有毒害作用；此外亦用時間長有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y-23Pectalyase Y-23，也叫離，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0.1-1.00.1-1.0，懸浮，懸浮細胞為細胞為0.050.05；D.D.崩潰酶崩潰酶（Driselase)Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；酶及果膠酶活性；（1）酶的類型15 酶液酶液pH值相當重要，纖維素酶及果膠酶值相當重要，纖維素酶及果膠酶單獨使用時，其單獨使用時，其pH分別以分別以4.0-5.0及及5.8為宜；為宜；混合使用時混合

7、使用時pH5.8-pH6.0為宜，降至為宜，降至4.8以下以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45m微微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。 （2）酶液的pH值16 維持原生質(zhì)體環(huán)境的滲透壓，保持原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定，避免原生質(zhì)體破裂。常用的兩種系統(tǒng)： 滲透穩(wěn)定劑（糖溶液系統(tǒng)）：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等；質(zhì)膜穩(wěn)定劑（鹽溶液系統(tǒng)）：CaCl2、MgS04和KH2PO4等。（3）酶液中的穩(wěn)定劑17材料預(yù)處理： 酶解過程：盡可能低的酶濃度，盡可能短的酶解時間，獲得盡可能大量的有活力的原生質(zhì)體；酶液用量：1g材料/10-20ml

8、酶液。（4）酶解處理酶解環(huán)境：25-30,黑暗或弱光。四、原生質(zhì)體的純化19采用采用40-300m的網(wǎng)篩過濾細胞混合液，除去未消化的細胞、的網(wǎng)篩過濾細胞混合液，除去未消化的細胞、細胞團、碎片，細胞團、碎片， 收集濾液，進行以下純化方法。收集濾液，進行以下純化方法。（1）沉降法：在適當溶劑內(nèi)低速離心使原生質(zhì)體下沉于）沉降法：在適當溶劑內(nèi)低速離心使原生質(zhì)體下沉于離心管底部，細胞碎片留在上清液中，如此收集得到的原離心管底部，細胞碎片留在上清液中，如此收集得到的原生質(zhì)，反復(fù)生質(zhì)，反復(fù)3-4次。次。（2）漂浮法：原生質(zhì)體比重較小，能在具有一定滲透壓）漂浮法：原生質(zhì)體比重較小，能在具有一定滲透壓的溶液（如

9、的溶液（如25%的蔗糖溶液）中漂浮，然后用吸管收集。的蔗糖溶液）中漂浮，然后用吸管收集。1、原生質(zhì)體的純化方法20（3 3）梯度離心法：利用比重不同的溶液，經(jīng)離心）梯度離心法：利用比重不同的溶液，經(jīng)離心后使完整無損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間，后使完整無損的原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間，而細胞碎片等雜質(zhì)則沉于管底。用這種方法可以而細胞碎片等雜質(zhì)則沉于管底。用這種方法可以獲得更為純凈的原生質(zhì)體。獲得更為純凈的原生質(zhì)體。1、原生質(zhì)體的純化方法21n用用300-400300-400目不銹鋼網(wǎng)過濾酶解材料目不銹鋼網(wǎng)過濾酶解材料, ,棄去殘渣棄去殘渣n吸去上清吸去上清n原生質(zhì)體重懸于原生質(zhì)體重懸于0.

10、16mol/L CaCl0.16mol/L CaCl2 22H2O2H2O溶液中溶液中n在容器底部緩慢注入在容器底部緩慢注入20%20%蔗糖溶液蔗糖溶液n收集兩層液面之間的純凈的原生質(zhì)體收集兩層液面之間的純凈的原生質(zhì)體600rpm, 5-10min600rpm, 5-10min原生質(zhì)體的純化步驟Purified protoplastsLeaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solutionPurification of protoplasts23原生質(zhì)體的分離與純化錄相五、原生質(zhì)體的活力測定25根據(jù)形態(tài)待征判斷根據(jù)形態(tài)

11、待征判斷其活力其活力：原生質(zhì)：原生質(zhì)體呈綠色（若來體呈綠色（若來源于葉片）及圓源于葉片）及圓而鼓者為活原生而鼓者為活原生質(zhì)體。質(zhì)體。1、目測法26 （1）FDA （熒光素雙（熒光素雙醋酸酯醋酸酯, ）染色法染色法(0.01%)原理原理:FDA本身無熒光，本身無熒光，無極性，能自由穿越細胞無極性，能自由穿越細胞質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，質(zhì)膜，在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解，分解形成熒被酯酶裂解，分解形成熒光素，熒光素不能自由穿光素，熒光素不能自由穿越細胞質(zhì)膜。越細胞質(zhì)膜。2、染色法27n（2 2）酚藏花紅染色法）酚藏花紅染色法（0.01%） ：無活力：無活力的原生質(zhì)體能被染成紅色，有活力的原生的原生質(zhì)體能

12、被染成紅色，有活力的原生質(zhì)體這中染料質(zhì)體這中染料, ,因此呈現(xiàn)無色。因此呈現(xiàn)無色。n（3 3）伊凡藍染色法）伊凡藍染色法（0.025%）：已受損傷）：已受損傷的的的原生質(zhì)體能的原生質(zhì)體能攝取這種染料呈現(xiàn)藍色，攝取這種染料呈現(xiàn)藍色，而完整的具活力的原生質(zhì)體不被染色。而完整的具活力的原生質(zhì)體不被染色。六、原生質(zhì)體的培養(yǎng) 與植株再生29 培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分無機鹽無機鹽：低大量元素濃度；高：低大量元素濃度；高Ca2+濃度。濃度。 有機成分有機成分：高的有機物濃度有利于細胞分裂，如：高的有機物濃度有利于細胞分裂，如KM8P（Kao等，等，1975)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。激素激素：不同種類要求差異較大；：不同

13、種類要求差異較大； pH值：值：5.5-5.9培養(yǎng)基滲透壓培養(yǎng)基滲透壓:培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲或略高培養(yǎng)基滲透壓與細胞滲透壓等滲或略高于細胞滲透壓。于細胞滲透壓。培養(yǎng)環(huán)境：初期培養(yǎng)時應(yīng)置于培養(yǎng)環(huán)境：初期培養(yǎng)時應(yīng)置于25-30、散射光或黑暗散射光或黑暗下培養(yǎng)下培養(yǎng)1、培養(yǎng)條件302、培養(yǎng)方法31將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)。層，封口后進行培養(yǎng)。優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。于添加新鮮培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點：缺點：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生

14、質(zhì)原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。況。液體淺層培養(yǎng) 在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點：優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可緩慢釋放到固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中加一液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)

15、物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。形成。缺點：缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。不易觀察細胞的發(fā)育過程。液體-固體雙層培養(yǎng) 即瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊脂糖與原生即瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊脂糖與原生質(zhì)體融化混合，將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于質(zhì)體融化混合，將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)。培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)。優(yōu)點：優(yōu)點： 可以跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的發(fā)育情可以跟蹤觀察單個原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體分裂頻率。況，易于統(tǒng)計原生質(zhì)體分裂頻率。缺點：缺點：操作要求嚴格，尤其是混合時的溫度掌操作要求嚴格，尤其是混

16、合時的溫度掌握必需合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，握必需合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易混合溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易混合均勻。均勻。固體平板培養(yǎng) 將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約管以大約50ul50ul一滴的量滴于直徑一滴的量滴于直徑6cm6cm的培養(yǎng)皿，的培養(yǎng)皿，待其待其固化后固化后向其中添加向其中添加3ml3ml液體液體培養(yǎng)基并于搖床培養(yǎng)基并于搖床上低速上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培

17、養(yǎng)物的滲透壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了其進一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質(zhì)培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。體的分裂和細胞團的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)35n初始植板密度一般為: 1104/ml 1105/ml3、植板密度36細胞壁再生細胞壁再生細胞分裂與生長細胞分裂與生長愈傷組織或胚狀體的形成愈傷組織或胚狀體的形成再生植株再生植株4、原生質(zhì)體再生植株的過程細胞壁的再生細胞壁的再生 原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細胞壁，原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整的細胞壁。一至數(shù)天內(nèi)便可形

18、成完整的細胞壁。 再生細胞壁的觀察方法：再生細胞壁的觀察方法：0.1% 0.1% 熒光增白劑熒光增白劑CPW CPW (calcofluor white)(calcofluor white)染色染色（CPWCPW可結(jié)合于新合成細胞壁的可結(jié)合于新合成細胞壁的- -糖糖苷上，在苷上，在400nm400nm激發(fā)光下可產(chǎn)生綠色熒光），激發(fā)光下可產(chǎn)生綠色熒光），有新細胞壁形成的有新細胞壁形成的原生質(zhì)體在細胞表面可見到綠色熒光圍繞。原生質(zhì)體在細胞表面可見到綠色熒光圍繞。 A-E, 培養(yǎng)的歐當歸培養(yǎng)的歐當歸(Levisticum officinale Koch)原生質(zhì)體分裂再生成植株的過程原生質(zhì)體分裂再生成

19、植株的過程 F-L, 培養(yǎng)過程的核變化；培養(yǎng)過程的核變化；F.多核，多核，G.核穿壁，核穿壁，H.無絲分裂，無絲分裂，I.染色體橋，染色體橋，J. 2n=22，K.L.多倍體多倍體. A-D當歸當歸(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗 E-H,紅豆草紅豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株 第二節(jié) 體細胞雜交40n細胞融合（細胞融合（Cell fusion）:是指使用人工方法使是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技兩個或兩個以上的細胞合并形成一

20、個細胞的技術(shù)。術(shù)。n植物體細胞雜交（植物體細胞雜交（Somatic hybridization）：）：來自不同親本的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融來自不同親本的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合、離體培養(yǎng)、再生成雜種植株的技術(shù)。合、離體培養(yǎng)、再生成雜種植株的技術(shù)。一、定一、定 義義41Tomato+Potato=Pomato1978年，年，Melchers獲得了第獲得了第一個一個屬間細胞雜種屬間細胞雜種（番茄（番茄馬鈴薯）；馬鈴薯）；42二、研究意義二、研究意義n雜交優(yōu)勢雜交優(yōu)勢：兩個遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物：兩個遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均進行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)

21、出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強、早熟高產(chǎn)、品優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等。質(zhì)優(yōu)良等。原生質(zhì)體雜交原生質(zhì)體雜交：可以：可以克服了遠緣雜交的不親和克服了遠緣雜交的不親和性性，使有性雜交根本無法獲得的種間、屬間、，使有性雜交根本無法獲得的種間、屬間、科間遠緣雜種成為現(xiàn)實?？崎g遠緣雜種成為現(xiàn)實。擬南芥雜交后代擬南芥雜交后代原生質(zhì)體的選擇n選擇適宜的原生質(zhì)體是決定原生質(zhì)體融合成敗的重要因素。n原生質(zhì)體選擇的考慮因素 ：q量多、活力強、遺傳一致；q易于再生植株 ；q具有可識別的異核體標記；q親緣關(guān)系不宜太遠。4344三、融合方式三、融合方式原生質(zhì)體融合可分為兩大類：原生質(zhì)體融

22、合可分為兩大類：q 自發(fā)融合自發(fā)融合( (spontaneous fusion) )由于由于去壁的裸細胞具有彼此融合的能力，在去壁的裸細胞具有彼此融合的能力，在制備原生質(zhì)體的酶解保溫處理過程中，制備原生質(zhì)體的酶解保溫處理過程中，相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成含有多相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成含有多個細胞核的融合體個細胞核的融合體。45q誘導(dǎo)融合（誘導(dǎo)融合（induced fusion）通過通過誘誘導(dǎo)劑導(dǎo)劑使兩個彼此相鄰的原生質(zhì)體相互融合的使兩個彼此相鄰的原生質(zhì)體相互融合的過程，稱為誘發(fā)融合。過程，稱為誘發(fā)融合。三、融合方式三、融合方式46（一）化學(xué)誘導(dǎo)融合（一）化學(xué)誘導(dǎo)融合：利用利用化學(xué)融合劑化

23、學(xué)融合劑，促，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。qNaNO3融合法融合法q高高pH 、高、高Ca2+法法q聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法誘導(dǎo)融合方法誘導(dǎo)融合方法47機理：機理：q原生質(zhì)體表面帶有負電荷原生質(zhì)體表面帶有負電荷(-10-30mV)，同性，同性質(zhì)電荷彼此凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜無法靠近到足質(zhì)電荷彼此凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜無法靠近到足以融合的程度。以融合的程度。q NaNO3中的鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的負中的鈉離子能中和原生質(zhì)體表面的負電荷，使凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜緊密接觸，促進電荷，使凝聚的原生質(zhì)體質(zhì)膜緊密接觸，促進細胞融合細胞融合.融合率融合率 0.

24、1%-4%。1 1、NaNONaNO3 3誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合482、PEG（聚乙二醇）與高（聚乙二醇）與高pH、高高Ca2+相結(jié)合誘導(dǎo)融合相結(jié)合誘導(dǎo)融合qPEG，能與水、蛋白質(zhì)、糖等具有正極性基團的極，能與水、蛋白質(zhì)、糖等具有正極性基團的極性物質(zhì)形成氫鍵，在相鄰原生質(zhì)體表面間作為分子性物質(zhì)形成氫鍵，在相鄰原生質(zhì)體表面間作為分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連q當當PEG分子被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分子被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團可分配。此時，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團可能與另外一個原生質(zhì)體中帶負電的基團相連，能與另外一個原生質(zhì)體中帶負電的

25、基團相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。49q鈣離子濃度決定著細胞膜的穩(wěn)定性和可塑性，影響原生鈣離子濃度決定著細胞膜的穩(wěn)定性和可塑性，影響原生質(zhì)體膜的結(jié)合；質(zhì)體膜的結(jié)合；q高高pH又能改變質(zhì)膜的表面電荷，有利于細胞融合又能改變質(zhì)膜的表面電荷，有利于細胞融合,但對但對細胞有毒害細胞有毒害；q在高在高Ca2+和和pH溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分分子洗脫，將進一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的子洗脫，將進一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的幾率。幾率。q融合率融合率10-50%2、PEG（聚乙二醇）與高（聚乙二醇）與高pH、高高Ca2+相結(jié)合誘導(dǎo)融合相結(jié)合

26、誘導(dǎo)融合50培養(yǎng)過程：愈傷組織不定芽根形成優(yōu)點：優(yōu)點： 融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合成本低，勿需特殊設(shè)備； 融合子產(chǎn)生的融合子產(chǎn)生的異核率異核率較高；較高； 融合過程不受物種限制。融合過程不受物種限制。缺點：缺點：融合過程繁瑣融合過程繁瑣PEG可能對細胞有毒害?？赡軐毎卸竞?。PEG法法誘導(dǎo)融合的特點誘導(dǎo)融合的特點51（二）電融合法（二）電融合法：利用利用改變電場改變電場來誘導(dǎo)原生來誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此連接成串，再施以質(zhì)體彼此連接成串，再施以瞬間強脈沖瞬間強脈沖使質(zhì)膜使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿而使原生質(zhì)體融合的方法。發(fā)生可逆性電擊穿而使原生質(zhì)體融合的方法。誘導(dǎo)融合方法誘導(dǎo)融合方法521 1、電融合

27、法的原理、電融合法的原理n在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。閉和成完整的膜形成融合體。53與與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點：融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點：不存在對細胞的毒害問題；不存在對細胞的毒害問題；融合技術(shù)操作簡便；融合技術(shù)操作簡便；融合效率高。融合效率高。2 2、電融合法的優(yōu)點、電融合法的優(yōu)點54細胞膜的接觸細胞膜的接觸：當原生質(zhì)體置

28、于：當原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；成串；3 3、電融合的基本過程、電融合的基本過程原生質(zhì)體成串原生質(zhì)體成串55膜的擊穿膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流予高頻直流脈沖脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。

29、56Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa)57n互補選擇法互補選擇法:指利用兩個親本具有不同遺傳和指利用兩個親本具有不同遺傳和生理特性生理特性, 在特定培養(yǎng)條件下在特定培養(yǎng)條件下,只有發(fā)生互補作用只有發(fā)生互補作用的雜種細胞才能生長的選擇方法。的雜種細胞才能生長的選擇方法。q抗性互補選擇法抗性互補選擇法q葉綠體缺失互補選擇法葉綠體缺失互補選擇法q營養(yǎng)代謝互補選擇法營養(yǎng)代謝互補選擇法q生長互補選擇法生長互補選擇法矮牽牛矮牽牛+爬山虎融合體的選擇爬山虎融合體的選擇四、融合細胞的篩選四、融合細胞的篩選58抗性互補選擇抗性互補選擇抗抗A不抗不抗B型細胞型細胞抗抗B不抗不抗A型細胞型細胞融合體融合體含含A、B培養(yǎng)基培養(yǎng)基雜種細胞雜種細胞59白化互補選擇法白化互補選擇法以矮牽牛為例：以矮牽牛為例：白化苗原白化苗原生質(zhì)體生質(zhì)體1白化苗原白化苗原生質(zhì)體生質(zhì)體2雜種細胞雜種細胞限定培養(yǎng)基限定培養(yǎng)基綠色愈傷組織綠色愈傷組織或幼苗雜種或幼苗雜種融合融合60營養(yǎng)缺陷型互補選擇營養(yǎng)缺陷型互補選擇Gly-型細胞型細胞Pro-型細胞型細胞融合融合Gly-、Pro-培培養(yǎng)基養(yǎng)基雜種細