1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取和鑒定的提取和鑒定 實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)一、目的與要求一、目的與要求1.1.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法及原理掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的方法及原理 2.2.了解用分光光度計(jì)測(cè)定了解用分光光度計(jì)測(cè)定DNADNA含量的方法含量的方法3.3.了解了解“過柱快提質(zhì)粒過柱快提質(zhì)粒DNADNA 二、 相關(guān)知識(shí)

2、及原理 質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid) (Plasmid) ： 獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 是一種環(huán)狀的雙鏈?zhǔn)且环N環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。分子。 存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。多。質(zhì)粒質(zhì)粒plasmidplasmid 是染色體外小型是染色體外小型1-200kb1-200kb的共價(jià)、閉合、的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子分子cccDNAcccDNA，能自主復(fù)制，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。并能穩(wěn)定遺傳的遺傳

3、因子。 經(jīng)常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基經(jīng)常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等酶、修飾酶等 質(zhì)粒的復(fù)制：質(zhì)粒的復(fù)制： 嚴(yán)緊型復(fù)制嚴(yán)緊型復(fù)制1n個(gè)個(gè) 松弛型復(fù)制松弛型復(fù)制20個(gè)以上個(gè)以上 細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒: : 細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從其大小從1Kb-200Kb1Kb-200Kb，它們復(fù)制時(shí)利，它們復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制本身基因組用宿主細(xì)胞復(fù)制本身基因組DNADNA的同的同一組酶系。一組酶系。 DNA超螺旋構(gòu)造超螺旋構(gòu)造常用的質(zhì)粒載體常用的質(zhì)粒載體 是

4、經(jīng)過是經(jīng)過DNADNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, pUC19pUC18, pUC19pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)InsertEcoRIXhoI1.9kb 嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)厲控嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)厲控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。

5、所以，往往在一個(gè)細(xì)胞中只需一份或幾份拷貝；往往在一個(gè)細(xì)胞中只需一份或幾份拷貝； 松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有10-20010-200份拷貝，份拷貝，假設(shè)用一定的藥物處置抑制寄主蛋白質(zhì)的合成假設(shè)用一定的藥物處置抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會(huì)使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒才會(huì)使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處置即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處置才干到達(dá)更高拷貝數(shù)。才干到達(dá)更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：質(zhì)粒類型： 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或

6、質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分別與提取是最常用、最要作用。質(zhì)粒的分別與提取是最常用、最根本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。根本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 載體載體(Vector)： 用于攜帶重組用于攜帶重組DNA，并且可以使外源，并且可以使外源DNA一同復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒一同復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒(運(yùn)載工具運(yùn)載工具)。載體具備的條件：載體具備的條件：適宜的容量適宜的容量在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；在受體細(xì)胞中可以獨(dú)立復(fù)制；易于鑒定；易于鑒定；易于挑選；易于挑選；易于制備；易于制備；易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。 啟始復(fù)制子啟始復(fù)制子ori,

7、 Origin of replication)ori, Origin of replication)； 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(MSC, Multiple cloning site (MSC, Multiple cloning site or polylinker)or polylinker)； 標(biāo)志基因標(biāo)志基因(Marker gene, such as LacZ (Marker gene, such as LacZ gene)gene)。 抗性基因抗性基因Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin re

8、sistance gene, gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)Kanamycine resistance gene)載體的構(gòu)造：載體的構(gòu)造：三、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)原理 堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差別來分別它們，在堿性性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差別來分別它們，在堿性PHPH，DNADNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNADNA不能不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒

9、DNADNA卻卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。 堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎一切純化質(zhì)粒的方法變性蛋白不溶而沉淀。幾乎一切純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒都用到質(zhì)粒DNADNA分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作緣由提取的質(zhì)?？捎腥N構(gòu)兩個(gè)特性。由于操作緣由提取的質(zhì)?？捎腥N構(gòu)造：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。造：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 堿裂解法堿裂解法根本原理：根本原理： 當(dāng)菌體在當(dāng)菌體在NaOHNaOH和和SDSSDS溶液中裂解時(shí)，蛋溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與白質(zhì)與DNADN

10、A發(fā)生變性，當(dāng)參與中和液后，質(zhì)發(fā)生變性，當(dāng)參與中和液后，質(zhì)粒粒DNADNA分子可以迅速?gòu)?fù)性，呈溶解形狀，離分子可以迅速?gòu)?fù)性，呈溶解形狀，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNADNA不復(fù)不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來 DNA DNA 是具有一定構(gòu)造的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)是具有一定構(gòu)造的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致境會(huì)導(dǎo)致DNADNA的變性，如加熱、極端的變性，如加熱、極端pHpH值、有機(jī)值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使使DNADNA復(fù)性。復(fù)性。 SDSSDS是一種陰離子外表活性劑

11、，它既能使細(xì)是一種陰離子外表活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白量變性，所以菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白量變性，所以SDSSDS處置細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從處置細(xì)菌細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒而使質(zhì)粒DNADNA以及基因組以及基因組DNADNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。來。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程 1.1.利用變性后形狀不同：在利用變性后形狀不同：在 pH 12.0pH 12.012.6 12.6 堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體 DNA DNA 變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的

12、質(zhì)粒 DNA DNA 雖雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞形狀。然變性但仍處于拓?fù)淅p繞形狀。2.2.利用溶解度的不同：將利用溶解度的不同：將 pH pH 調(diào)至中性并有調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體 DNA DNA 、大分子量的、大分子量的 RNA RNA 和蛋白質(zhì)在去污劑和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS SDS 的作用下構(gòu)成沉淀，而質(zhì)粒的作用下構(gòu)成沉淀，而質(zhì)粒 DNA DNA 依然依然為可溶形狀。為可溶形狀。3.3.利用離心力的不同：經(jīng)過離心，可除去大利用離心力的不同：經(jīng)過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體部分細(xì)胞碎片、染色體 DNADNA、RNARNA及蛋

13、白質(zhì)，及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA尚在上清中，尚在上清中，4.4.利用酚變性結(jié)果不同：然后用酚、氯仿抽利用酚變性結(jié)果不同：然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA DNA 。 釋放出來的釋放出來的DNADNA遇到強(qiáng)堿性遇到強(qiáng)堿性NaOHNaOH環(huán)境，環(huán)境，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒使溶液處于中性，質(zhì)粒DNADNA將迅速?gòu)?fù)性，而基將迅速?gòu)?fù)性，而基因組因組DNADNA，由于分子宏大，難以復(fù)性。離心后，由于分子宏大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA將在上清中，而基因組將在上清中，而基因組DNADNA那么

14、與細(xì)胞那么與細(xì)胞碎片一同沉淀到離心管的底部。碎片一同沉淀到離心管的底部。 經(jīng)過這種方法即可將質(zhì)粒經(jīng)過這種方法即可將質(zhì)粒DNADNA從細(xì)菌中提從細(xì)菌中提取出來。取出來。細(xì)菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,普通用于質(zhì)粒大量提取。提純的思緒提純的思緒 質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNADNA 要去除的物質(zhì)：要去除的物質(zhì)： 蛋白蛋白 基因組基因組DNADNA 脂類及小分子雜質(zhì)脂類及小分子雜質(zhì) RNA RNA 一切分別質(zhì)粒一切分別質(zhì)粒DNADNA的方法都包括的方法都包括3 3個(gè)根

15、本步驟：個(gè)根本步驟： 培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； 搜集和裂解細(xì)菌；搜集和裂解細(xì)菌； 分別質(zhì)粒分別質(zhì)粒DNA( DNA( 有時(shí)還要求純化質(zhì)粒有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA)DNA)質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取方法的提取方法 方法：方法： 堿裂解法；堿裂解法； 煮沸裂解；煮沸裂解； 羥基磷灰石柱層析法，羥基磷灰石柱層析法， 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA釋放法；釋放法； 酸酚法等。酸酚法等。 概括起來主要是用非離子型或離子型概括起來主要是用非離子型或離子型去污去污 劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)展處置及劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)展處置及用加熱處置用加熱處置 選擇哪種方法主要取決于以下選擇哪種方法主要取決于以下幾個(gè)要素：幾

16、個(gè)要素： 質(zhì)粒的大小、質(zhì)粒的大小、 大腸桿菌菌株、大腸桿菌菌株、 裂解后用于純化的技術(shù)裂解后用于純化的技術(shù) 實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)要求四、實(shí)驗(yàn)儀器、資料與試劑四、實(shí)驗(yàn)儀器、資料與試劑 一儀器：恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、一儀器：恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、 臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋二資料：含二資料：含pUC19pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌、質(zhì)粒的大腸桿菌、 LBLB液體培育基，氨芐青霉素液體培育基，氨芐青霉素三試劑：三試劑： 溶液溶液I I作用：作用： 分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活 溶液溶液IIII作用：作用： 細(xì)胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白量變性。細(xì)胞壁

17、肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白量變性。 溶液溶液IIIIII作用：作用： 酸性下質(zhì)粒酸性下質(zhì)粒DNADNA復(fù)性，變性蛋白復(fù)性，變性蛋白SDSSDS線性線性 DNADNA沉淀，沉淀，K K可中和可中和DNADNA平衡酚：氯仿：異戊醇平衡酚：氯仿：異戊醇2525：2424：1 1作用：作用： 氯仿可使蛋白量變性并有助于液相與有氯仿可使蛋白量變性并有助于液相與有機(jī)相的分別。平衡酚機(jī)相的分別。平衡酚pH7.8pH7.8酸性下酸性下DNADNA分配于分配于有機(jī)相，酚的密度大，可使有機(jī)相，酚的密度大，可使DNADNA在上清中。在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡

18、沫。 注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。起灼傷。 無水乙醇：無水乙醇： 除去除去DNADNA水化層，使水化層，使DNADNA沉淀沉淀 TETE緩沖液：緩沖液： 溶解溶解DNADNA 五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟 一一 細(xì)菌培育與質(zhì)粒擴(kuò)增細(xì)菌培育與質(zhì)粒擴(kuò)增 1. 挑單克隆E.coli菌株接種到斜面培育基上 活化菌種，37過夜培育 2. 從斜面培育基上挑E.coli菌株，接種于25毫升 液體培育液內(nèi)含氨芐青霉素，37振蕩， 250 r/min 過夜培育。 3. 從中取4毫升種子菌液于含 LB 培育基中含 Ap，37振蕩培育3-4小時(shí)OD6001.0。 二質(zhì)粒提

19、二質(zhì)粒提取取取取1.5ml1.5ml培育物倒入培育物倒入EppendorfEppendorf管中，管中，12000r/min12000r/min，44，30sec30sec。吸去培育液，使細(xì)胞沉淀盡能夠枯燥吸去培育液，使細(xì)胞沉淀盡能夠枯燥將細(xì)菌沉淀懸浮于將細(xì)菌沉淀懸浮于100l100l預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液I I中，中，猛烈振蕩。猛烈振蕩。4.4.加加200L200L溶液溶液IIII新穎配制，蓋緊新穎配制，蓋緊Eppendorf Eppendorf 管，快速顛倒管，快速顛倒5 5次，混勻內(nèi)容物，將次，混勻內(nèi)容物，將 Eppendorf Eppendorf 管放在冰上。管放在冰上。5.5.參與參與

20、150L150L溶液溶液IIIIII冰上預(yù)冷，蓋緊管冰上預(yù)冷，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置5min 5min 6.12 000r/min6.12 000r/min，離心，離心5min5min，將上清夜轉(zhuǎn)至另，將上清夜轉(zhuǎn)至另一一EppendorfEppendorf管中管中 。7. 7. 向上清夜參與向上清夜參與2 2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置倍體積乙醇，混勻后，室溫放置5-10min5-10min。12000r/min12000r/min離心離心5min5min。倒去上清夜，。倒去上清夜，把把EppendorfEppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。管倒

21、扣在吸水紙上，吸干液體。 8. 8. 用用1ml 70%1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒乙醇洗滌質(zhì)粒DNADNA沉淀，振蕩并離心，沉淀，振蕩并離心，倒去上清夜，真空抽干或空氣中枯燥。倒去上清夜，真空抽干或空氣中枯燥。9. 50L TE9. 50L TE緩沖液，使緩沖液，使DNADNA完全溶解完全溶解-20-20保保管。管。 用移液器操作時(shí)，每一步都要格用移液器操作時(shí)，每一步都要格外小心，特別是在參與溶液外小心，特別是在參與溶液II 和和III后，后，一定不要猛烈振蕩，以免切碎一定不要猛烈振蕩，以免切碎DNA(包包括質(zhì)粒括質(zhì)粒DNA和基因組和基因組DNA)！三實(shí)驗(yàn)步驟流程三實(shí)驗(yàn)步驟流程接含接含pUC1

22、8(pUC18(或或pET21a)pET21a)質(zhì)粒的單菌落于質(zhì)粒的單菌落于3ml LB3ml LB Amp+ Amp+液體培育基中液體培育基中370C370C，190rpm190rpm振蕩培育過夜振蕩培育過夜取取1.51.5菌液入菌液入1.5ml1.5ml的的dorfdorf管中管中 6000rpm6000rpm、離心、離心2min2min，棄上清，搜集菌體，棄上清，搜集菌體100L100L溶液溶液I I懸浮菌體充分振蕩，室溫或冰懸浮菌體充分振蕩，室溫或冰浴浴10min10min參與參與200L200L溶液溶液IIII悄然混勻，冰上靜置悄然混勻，冰上靜置5min5min裂裂解菌體解菌體參與參與150L150L溶液溶液IIIIII悄然混勻，冰上靜置悄然混勻，冰上靜置15min15min質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA復(fù)性復(fù)性12000r/min12000r/min，離心，離心15min15min，取上清記錄體積到一新管，取上清記錄體積到一新管上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇振蕩混勻上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇振蕩混勻