1、 臨床十二大班92012級本科分子生物學實驗設計案例患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。體格檢查：體溫38，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經系統(tǒng)檢查未及異常。實驗室檢查：紅細胞 1.981012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5mol/L，結合膽紅素13.7mol/L，未結合膽紅素71.8mol/L，尿蛋白（+），潛血(+)，

2、尿膽紅素()，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細胞。案例分析1、惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，臉色蒼白， 皮膚及鞏膜黃染（伴有溶血性黃疸）2、心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經系統(tǒng)檢查未及異常（癥狀不嚴重）案例分析3、血象 紅細胞 1.981012/L（）4.05.51012/L 血紅蛋白53g/L（） （110-150G/L ） 血清總膽紅素85.5mol/L（）1.71-17.1mol/L4、尿常規(guī) 尿液下未見紅細胞（紅細胞膜已不完整） 尿膽素原呈陽性輕度蠶豆病并伴溶血性黃疸 根據以上信息和檢查診斷蠶豆病簡介蠶豆病是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏所導致的疾病，表現

3、為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內溶血。 多見于兒童，男性患者約占90%以上。 臨床表現早期有惡寒、微熱、頭昏、倦怠無力、食欲缺乏、腹痛，繼之出現黃疸、貧血、血紅蛋白尿，尿呈醬油色，此后體溫升高，倦怠乏力加重，可持續(xù)3日左右。與溶血性貧血出現的同時，出現嘔吐、腹瀉和腹痛加劇，肝臟腫大，肝功能異常，約50%患者脾大。嚴重病例可見昏迷、驚厥和急性腎衰竭，若急救不及時常于12日內死亡。紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定（紫外法）設計實驗進一步明確診斷實驗原理要檢測G6PD的活性，可以檢測NADPH生成量實驗原理已知：NADPH在340n

4、m的紫外線照射下產生熒光即可以每隔2分鐘在340nm波長下測定孵育液中NADPH吸光度以10min吸光度值的變化（A340）計算NADPH的產量。實驗原理還原型谷胱甘肽使高鐵血紅蛋白還原為血紅蛋白2G-SHMHb HbG-S-S-GNADP+ NADPH即可以檢測血紅蛋白的含量實驗器材和試劑1.實驗器材 恒溫水循環(huán)紫外分光光度計，可見分光光度計，離心機。2.試劑（1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2緩沖溶液（pH8.0）：稱取Tris12.1g,MgCl26H2O 4.06g,加入160mL蒸餾水溶解，用HCl調pH至8.0，然后加入蒸餾水至200mL。（2）2 mmol/L煙酰

5、胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)：稱取NADP 21.3mg，溶于10mL蒸餾水中。4 可保存20天左右。（3）6mmol/L葡萄糖6磷酸二鈉(G6PNa2)：稱取21.5mg G6PNa22H2O，溶于10mL蒸餾水中。4 可保存20天左右。（4）溶血劑：取巰基乙醇0.1mL，10% EDTA 2.0mL，6mmol/L NADP 0.4mL，加蒸餾水至總體積200mL。（5）血紅蛋白氧化劑（Drabkin試劑）：稱取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸餾水至1000mL，置棕色瓶內避光保存，可保存20天。（6）0.9% NaCl，ACD抗凝劑。實

6、驗器材和試劑 實驗操作流程1、洗滌紅細胞 取靜脈血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝劑的試管中，混勻。吸取0.2mL抗凝血放入試管中，加入4mL預冷的生理鹽水，輕輕搖勻，2500r/min離心5min,傾去上清，重復三次。2、溶血液的制備 向紅細胞沉淀中加入溶血劑2.0mL，震蕩1min，4放置10min以上。3、NADPH的測定 取石英比色杯兩只，標為“測定”及“空白”，按下表操作：試劑體積蒸餾水（uL）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2緩沖溶液（uL）6mmol/L G6P-Na2 (uL)2mmol/L NADP+ (uL)2040300300300混勻后放入帶恒溫水循環(huán)

7、（25）的紫外分光 光度計中，預熱10min然后在“測定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入溶血劑60uL，混勻以“空白”調“0”,1min后開始測340nm吸光度（A340），每2min紀錄吸光度一次，至10min止，比較每2minA值的變化情況，若相近則表明酶促反應平穩(wěn)。以10minA值的變化（A340）計算NADPH的產量。4.溶血液中血紅蛋白含量的測定 取試管一支，按下表操作：試劑體積Drabkin(mL)溶血液(mL)0.33.0混勻，室溫放置15min，以Drabkin試劑調零，讀取540nm的吸光度（A540）。注意事項1.洗滌紅細胞時禁止劇烈震蕩，避免溶血。2.測定NADPH

8、時讀取吸光度的時間要準確。結果分析1.NADPH產量的計算 NADPH在340nm處，其每微摩爾的吸光系數（）為6.220，故10min內NADPH的產量計算公式為：NADPH產量（mol） =2.血紅蛋白含量的計算 血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白以后，在540nm處，其毫摩爾吸光細數（）為44，故溶血液中血紅蛋白的含量計算公式為：血紅蛋白含量（mmol）=3.G6PD比活性（U/g Hb）的計算G6PD比活性單位（U/g Hb）=【參考范圍】正常值：大于2.8U/gHb從生化代謝解釋患兒的臨床表現和實驗室檢查結果生化角度實驗室檢查檢查項目檢查值正常值紅細胞 1.981012/L 4.05.010

9、12/L血紅蛋白 53g/L 120160g/L血清總膽紅素 85.5mol/L 3.417.1mol/L結合膽紅素 13.7mol/L 總量的20%未結合膽紅素 71.8mol/L 總量的80%結果導致紅細胞膜的破壞膽色素代謝異常G6PD磷酸戊糖途徑NADPH磷酸戊糖維持谷胱甘肽的還原性核酸生物合成原料紅細胞膜的破壞谷胱甘肽阻止氧化血紅蛋白，從而保護紅細胞膜的完整性，如若缺乏，此時的紅細胞易于破裂 。NADPH高鐵血紅蛋白還原酶 GSHMHbHb紅細胞膜的破壞膽紅素鐵卟啉類化合物的降解產物80%以上來自衰老紅細胞破壞所釋放的血紅蛋白的分解自由通過生物膜產生毒性作用G6PD缺乏NADPH嚴重缺

10、乏谷胱甘肽難以保持還原狀態(tài)NADPH高鐵血紅蛋白還原酶活性低 紅細胞膜完整性破壞紅細胞裂解血紅蛋白大量溢出膽紅素生成量增加Hb大量氧化成MHb，Hb含量減少具體分析皮膚及粘膜黃染 血清總膽紅素超過17mol/L即為高膽紅素血，一般若在1734mol/L，臨床無明顯黃疸，為隱性黃疸，超過34mol/L則可見皮膚、粘膜黃染。血尿 急性溶血時大量紅細胞被破壞，其成分從尿液中排除故出現血尿。具體分析 體溫升高 大量溶血，即血紅細胞大量破壞，大量的無菌性壞死物質入血，機體動員白細胞吞噬吸收壞死物質，導致無菌性炎癥，可引起發(fā)熱，亦稱為吸收熱。 呼吸加快及心律升高 由于急性溶血導致循環(huán)血量減少，紅細胞減少，

11、 血紅蛋白減少，氧氣供應相對不足，故機體通過加快呼吸頻率，以及加快心率維持心輸出量的相對穩(wěn)定以維持機體代謝的供氧?；颊唧w型瘦小與該病癥是否有關，為什么？（選答） 患者體型瘦小與該病癥有關 蠶豆病是因為體內缺乏G6PD， G6PD主要影響體內的磷酸戊糖途徑 該途徑主要生成兩種重要的物質即5-磷酸核糖和NADPH5-磷酸核糖影響：1：核酸的合成 2：體內己糖和戊糖的代謝 3：37碳原子糖類物質的相互轉化G6PDNADPH影響：1：體內以NADPH作為供氫體合成多種活性物質如膽固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸2： NADPH可作為羥化酶的輔酶，參與體內生物轉化作用3： NADPH參與吞噬細胞的殺菌作

12、用4：維持GSH的正常水平 GSH可以保護體內蛋白質或酶免遭氧化 使蛋白質或酶處于活性狀態(tài)磷酸戊糖途徑中生成多余的核糖轉變?yōu)?-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛進入糖酵解途徑，G6PD缺乏使得糖代謝受到影響。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是儲存和氧化能量，機體難以合成甘油三酯則消耗原有儲備的甘油三酯，使得機體消瘦。同時體內的一些生物活性物質功能發(fā)生障礙，如膽固醇不能直接氧化但能轉化為膽汁酸、類固醇激素 、維生素D3，參與物質代謝調節(jié)，膽汁酸具有促進脂類消化和吸收的作用；維生素D3主要參與體內血鈣和血磷的調節(jié)。生物轉化作用可以對體內大部分非營養(yǎng)物質進行代謝轉化，或使有毒物質的毒性減低或消除，增強這些非營養(yǎng)物質的水溶性和極性