1、人類胚胎肌肉細(xì)胞體外自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化抑癌基因的改變【摘要】目的:研究人類胚胎肌肉源性自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系抑癌基因的改變方法：運用免疫組化、pr,pr產(chǎn)物直接測序研究該類細(xì)胞系抑癌基因p16,p15,tap(甲硫氨酸磷酸化酶)和p53基因及蛋白的改變結(jié)果：在染色體9p21處存在純合性片段缺失，包括p16，p15及tap；對p53基因突變率高發(fā)的外顯子7，8及內(nèi)含子7測序發(fā)現(xiàn)存在范圍較大的突變，外顯子突變率高達(dá)13%，皆為點突變，而內(nèi)含子變異更甚，包括小片段缺失、插入、移位及點突變，其幾與正常p53序列無明顯相似性，在測序的6個細(xì)胞系中含5個不同遺傳背景突變序列具有高度一致性結(jié)論：多種抑癌基因的變異在正

2、常胚胎肌肉細(xì)胞自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程中具有重要的作用【關(guān)鍵詞】惡性轉(zhuǎn)化基因腫瘤抑制肉瘤染色體9p21p53基因突變0引言1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)人類胚胎肌肉細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代方法參考文獻(xiàn)8在取材5個不同遺傳背景胚胎肌肉進(jìn)展培養(yǎng)47后自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化，并能穩(wěn)定維持體外長期傳代,至今惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞體外培養(yǎng)已達(dá)1-3a其中有2個細(xì)胞系來自同一個胚胎肌肉細(xì)胞的不同培養(yǎng)時期惡性轉(zhuǎn)化，命名為s5b和s5.其它4個細(xì)胞系分別命名為s0812,s0504,s3,s4.s0812和s0504細(xì)胞系的性質(zhì)在我們的前期研究中已經(jīng)有報道81.2基因組dna的提取采用寶生物公司的universalgenidnaextratin

3、kitver.3.0takarabitehnlgy(dalian).,ltd.，按使用說明標(biāo)準(zhǔn)操作表1引物序列略1.4p53外顯子78測序?qū)?個胚胎自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化肌肉細(xì)胞系s0812,s0504,s3,s4,s5b,s5提取dna,擴增p53外顯子7,8，pr產(chǎn)物送上海生工公司純化后直接測序9，測序儀為abipris3730，測序染料為bigdyeterinatr1.5p16免疫組化將腫瘤細(xì)胞接種于35培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁飽和度80左右，棄去培養(yǎng)基，按單層貼壁細(xì)胞免疫組化實驗步驟操作，一抗為20倍稀釋的鼠抗p16ab北京中衫金橋生物技術(shù)，應(yīng)用ae染色法進(jìn)展顯色后照相，陽性對照用人正常胚胎肌肉細(xì)胞2

4、結(jié)果2.1腫瘤細(xì)胞系9p21處片段缺失在個樣本的pr擴增中都出現(xiàn)p16外顯子1,2,3，p15外顯子1及tap外顯子4,5,6,7的純合性缺失圖1a-d而tap外顯子2,3那么有模糊條帶及非特異性擴增圖未示，正常對照那么無非特異性擴增圖1e，提示其可能在附近存在斷裂位點圖1腫瘤細(xì)胞系9p21處片段缺失略2.2p16免疫組化陽性對照正常胚胎肌肉細(xì)胞可見胞質(zhì)泛染(圖2a)，而肉瘤細(xì)胞系那么顯示陰性(圖2b).a：正常胚胎肌肉細(xì)胞陽性；b：肉瘤細(xì)胞系.圖2p16免疫組化陰性s3細(xì)胞系略2.3p53外顯子7,8及內(nèi)含子7測序在對6個樣本s0812,s0504,s3,s4,s5b,s5的p53外顯子78

5、測序發(fā)現(xiàn)其外顯子7與正常p53序列比對其同源性為92，外顯子8為86左右，內(nèi)含子7與正常p53序列比對局部幾無明顯相似性,予人工比對,其余局部可比對(圖3)其中，外顯子皆為點突變，內(nèi)含子突變類型有點突變，缺失、插入3討論p16蛋白能抑制ylind/dk4，阻止prb磷酸化，從而抑制細(xì)胞分裂進(jìn)入s期，在多種腫瘤中可觀察到其失活10-12我們通過對人胚胎肌肉細(xì)胞的長期培養(yǎng)，約47后其自發(fā)轉(zhuǎn)化為惡性增殖細(xì)胞系8，pr及免疫組化結(jié)果均支持其存在缺失，而非單純的點突變tap蛋白是嘌呤和甲硫氨酸合成補救途徑中一個關(guān)鍵酶13，在人或鼠源的多種惡性細(xì)胞系和人多種腫瘤中有較高頻率的純合性缺失，多與p16缺失伴隨

6、出現(xiàn)10文獻(xiàn)報道在96個骨肉瘤組織中至少一個外顯子缺失率的到達(dá)37.5%12我們對人胚胎肌肉惡性化細(xì)胞系體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞系表現(xiàn)肉瘤性質(zhì)8pr擴增其tap外顯子27結(jié)果顯示47純合性缺失p53蛋白在超過半數(shù)以上的不同腫瘤中存在突變，其中錯義突變約占74%,高于其它抑癌基因發(fā)生的頻率，從而導(dǎo)致其正常功能的失活及突變蛋白的產(chǎn)生14p53基因的突變在軟組織肉瘤中很常見，特別是在轉(zhuǎn)移組織及高度惡性化的類型中15而且，研究發(fā)現(xiàn)各種p53突變對腫瘤的惡性化程度、肉瘤患者的生存率等有顯著的影響，即野生型p53功能的消失或抑制，突變型p53蛋白的獲得性致癌才能會促進(jìn)腫瘤的發(fā)生開展，降低患者生存率14所以，對

7、p53基因的研究有助于更好的說明細(xì)胞自發(fā)惡性化進(jìn)程的分子機制而文獻(xiàn)報道關(guān)于肉瘤p53基因的變異大多是點突變包括內(nèi)含子16引起的蛋白編碼改變，從而產(chǎn)生突變型p53蛋白現(xiàn)已在genbank數(shù)據(jù)庫中確認(rèn)的關(guān)于p53的snp位點很多,我們在6個細(xì)胞系5個不同遺傳背景自發(fā)惡性化的12次測序結(jié)果雙向測序顯示，其外顯子突變與現(xiàn)有確認(rèn)的p53snp位點是不同的;內(nèi)含子7更表現(xiàn)出極大的基因變異，其中包括小片段缺失及點突變，這與以往報道的p53內(nèi)含子突變是完全不同的17，且12次測序結(jié)果具有高度一致性a:上序列為腫瘤細(xì)胞系(6個細(xì)胞系測序序列一樣)序列,下序列為正常人p53外顯子7;b：測序p53內(nèi)含子7上半局部

8、序列,因其在genbank數(shù)據(jù)庫比對后示無明顯相似序列,予人工比對;:測序p53內(nèi)含子7下半局部序列,使用blast比對;d:測序p53外顯子8.圖3測序結(jié)果略綜上研究結(jié)果，我們初步發(fā)如今人類胚胎肌肉自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中一些抑癌基因的改變：9p21處存在片段缺失，其中包括p16、p15及tap其缺失導(dǎo)致周期蛋白抑制功能的喪失，在基因程度上為腫瘤細(xì)胞失控的分裂增殖才能解除了限制，分裂才能的增強將加速基因突變頻率及癌基因的累積p53抑癌基因在外顯子7、8的點突變及內(nèi)含子的大范圍改變，將肯定影響p53蛋白的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)14,18,3.6個自發(fā)惡性化細(xì)胞系結(jié)果完全一致，提示其突變形式具有強大的選擇優(yōu)勢然

9、而，我們對胚胎肌肉來源的自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化肉瘤細(xì)胞系dki家族及p53基因的研究還只局限在基因組程度，且還有其他突變率較高的區(qū)域未予明確故接下來仍須在dki家族及p53通路等方面進(jìn)展更深化的研究相信隨著對自發(fā)惡性化肉瘤細(xì)胞系抑癌基因的深化研究，將有助于更好的解釋人正常胚胎肌肉細(xì)胞自發(fā)惡性化進(jìn)程的關(guān)鍵分子學(xué)機制，為尋找新的基因治療途徑提供幫助【參考文獻(xiàn)】1iankg.theretinblastagene:rleinellylentrlandelldifferentiatinj.fasebj,1993,7(10):841-845.3xu,qianh,zhu,etal.anvelturelllinelnedfrutatedhuanebrynibnearresenhyalsteellsj.nlrep,2022,12(3):501-508.4asak,yasu,hesed,etal.auulatedhrsalinstabilityinurinebnearresenhyalsteellsleadstalignanttransfratinj.steells,2022,24(4):1095-1