1、表 一福州大學(xué)碩士研究生論文開題報告論文題目海參集約化養(yǎng)殖機理及其加工利用姓 名黃明意學(xué) 號120820040性 別男導(dǎo) 師陳劍鋒學(xué)科專業(yè)發(fā)酵工程研究方向產(chǎn)品分離與加工工程學(xué) 院生物科學(xué)與工程學(xué)院開題報告時間、地點導(dǎo)師審核意見導(dǎo)師簽名： 年 月 日審核小組意見（注：需對開題報告的總體情況進行評價，指出不足和建議，并明確是否同意開題報告通過。）審核小組成員簽名： 年 月 日院領(lǐng)導(dǎo)意見 院領(lǐng)導(dǎo)簽名： 年 月 日一、論文選題依據(jù)（包括本課題國內(nèi)外研究現(xiàn)狀述評，研究的理論與實際意義，對科技、經(jīng)濟和社會發(fā)展的作用等）海參（Holothurioidea），海參是歸屬于無脊椎動物棘皮動物門(Echinode

2、rmata)海參綱(Holothuridea)的無脊椎動物。其典型的代表為刺參(Stichopus japonicus)，是被稱為“海中人參”的海產(chǎn)珍品，有著極高的營養(yǎng)價值，在中國和日本都非常受歡迎 1，是我國傳統(tǒng)的名貴海產(chǎn)品2是傳統(tǒng)的海產(chǎn)“八珍”之一。但是它的人工養(yǎng)殖歷史不是很長，我國自20世紀50年代以來，我國進行了與海參養(yǎng)殖相關(guān)的多項實踐，如在天然海域投放參苗進行人工增殖的、刺參人工育苗及增養(yǎng)殖技術(shù)的研究、刺參大水體高密度人工育苗、開拓多種養(yǎng)殖模式和養(yǎng)殖技術(shù)、進行工廠化養(yǎng)殖等，為海參的養(yǎng)殖提供了強有力的技術(shù)支撐3。目前沿海地區(qū)海參人工養(yǎng)殖方式主要有，井鹽水工廠化養(yǎng)殖、灘涂圍塘養(yǎng)殖、淺海底

3、播養(yǎng)殖等。其中井鹽工廠化養(yǎng)殖規(guī)模較小，養(yǎng)殖海參的環(huán)境控制和防疫復(fù)雜，產(chǎn)品品質(zhì)難以有效保證4。而圍塘養(yǎng)殖的主要瓶頸則主要是，面臨的成本、質(zhì)量、環(huán)境問題。如單位水面投苗密度大、成活率低、產(chǎn)品品質(zhì)低、產(chǎn)出率不高。尤其是隨著沿海養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和近海水面利用強度的日益提高，近海海水水質(zhì)污染的問題越來越嚴重，時常發(fā)生的極端自然氣象災(zāi)害也對圍塘海參養(yǎng)殖產(chǎn)生重大不利影響。 正是由于上述傳統(tǒng)養(yǎng)殖方式所遇到的問題，因此發(fā)展室內(nèi)海參集約化增養(yǎng)殖技術(shù)，提高海參的養(yǎng)殖產(chǎn)量和對外界環(huán)境變化抵抗能力；提高海參養(yǎng)殖的經(jīng)濟價值；將具有重要的實際和理論意義。與此同時在探索海參海參集約化增養(yǎng)殖的機理的同時，通過正交試驗可以尋找

4、海參生長的最優(yōu)條件5組合，如找到其鹽度，溫度,ph等因子的最優(yōu)組合提高。與此同時在海參養(yǎng)殖過程中找到其對某些水質(zhì)因子的耐受范圍，如水中總氮，總磷的耐受范圍，以及正常范圍內(nèi)葉綠素的含量，因而可以通過對水質(zhì)的檢測，使其控制在合理的范圍內(nèi)，提高海參的存活率和生長效率，從而實現(xiàn)較高的經(jīng)濟價值。二、論文的研究內(nèi)容、研究目標,以及擬解決的關(guān)鍵問題（包括具體研究與開發(fā)的主要內(nèi)容、目標和要重點解決的關(guān)鍵技術(shù)問題）本課題研究目標海參是一種經(jīng)濟價值很高的名貴水產(chǎn)，現(xiàn)在人工養(yǎng)殖的方法主要有井鹽水工廠化養(yǎng)殖、灘涂圍塘養(yǎng)殖、淺海底播養(yǎng)殖，等3但是他們都面臨著易受外界環(huán)境影響，尤其是海參的養(yǎng)殖地點主要是沿海地帶，易受臺風(fēng)

5、的影響，當臺風(fēng)到來時往往會帶來大量的降水，降水會導(dǎo)致養(yǎng)參池水的鹽度降低，而海參在鹽度低于26的海水中會生長不正常甚至死亡6，因此本課題的目的有實現(xiàn)室內(nèi)集約化養(yǎng)殖；發(fā)展生態(tài)海參養(yǎng)殖技術(shù)，把海參，蝦，蟹，以及海帶等水生植物的培養(yǎng)結(jié)合起來。本課題主要研究內(nèi)容1、海參增養(yǎng)殖生理生化機制的探索。主要通過正交試驗實驗尋找出海參生長的最適水體環(huán)境（DO,溫度ph,鹽度）和水質(zhì)因子組合，2、海參加工利用的研究以及自制餌料研究的探索。海參加工利用的主要方法有直接食用，以及對海參的干制等，而且海參的干制后的廢液，可以進行海參皂苷的提取7。除此之外對海參體內(nèi)微生物進行篩選，以及對耐鹽微生物的篩選，以及對海帶紫菜的海

6、生植物的加工，為自制餌料提供實驗依據(jù)。3、海參餌料的利用效率及其成分累積規(guī)律。餌料的利用效率主要通過比較外購的商品餌料和自制的人工餌料的對比。4、從海參廢液加工中提取膠原蛋白，讓其與京尼平進行交聯(lián)的探索。重點解決的關(guān)鍵技術(shù)1、海參自制餌料的探索，主要是海泥中耐鹽微生物和海參內(nèi)臟中微生物的篩選，；2、海參工程化研究的探索；3、膠原蛋白與京尼平交聯(lián)最有條件的探索。三、擬采取的研究方案及可行性分析(包括研究的基本思路，研究過程擬采用的方法和手段，現(xiàn)有研究條件和基礎(chǔ)，研究開發(fā)方案和技術(shù)路線等)第一部分 擬采取的研究方案1 海參增養(yǎng)殖生理生化機制的探索。1.1水質(zhì)環(huán)境的監(jiān)測1.1.1總磷（TP）測定取1

7、2個25ml比色管，第1個加入超純水25ml做空白，后11個分別加入25ml原水樣。之后加入4ml過硫酸鉀溶液，塞緊磨口塞用布及繩扎緊瓶塞，以防彈出。再將比色管置于高壓滅菌器中121加熱45min，冷卻后取出比色管并冷至室溫。之后加入抗壞血酸1ml，混勻，30s后加鉬酸鹽2ml，搖勻后放置10min，在700nm下比色。記錄OD值。再根據(jù)計算公式：總磷含量CN（mg/L）=KmN/V計算出總磷含量。式中：mN總磷質(zhì)量（g），由As-Ab值和相應(yīng)比色皿光程的校準曲線確定。V試份體積（ml），K稀釋倍數(shù)。1.1.2樣品總氮（TN）測定該實驗的測定方法有過硫酸鉀消解硫酸肼還原 NEDD光度法8，取1

8、2個25ml比色管，第1個加入超純水10ml做空白，后11個分別加入10ml混勻原水樣。之后加入5ml堿性過硫酸鉀溶液，塞緊磨口塞用布及繩扎緊瓶塞，以防彈出。再將比色管置于高壓滅菌器中121加熱45min，冷卻后取出比色管并冷至室溫。將之后加入（1+9）鹽酸1ml，用去離子水稀釋至25ml標線，搖勻后分別在220nm與275nm下比色。記錄OD值。再根據(jù)計算公式：總氮含量CN（mg/L）=KmN/V計算出總氮含量。式中：mN總氮質(zhì)量（g），由As-Ab值和相應(yīng)比色皿光程的校準曲線確定。V試份體積（ml），K稀釋倍數(shù)。葉綠素a(Chla)測定采用的方法主要有分光光度計法9 10，用0.45m濾膜

9、抽濾200ml水樣，將濾膜向內(nèi)對折放入25ml比色管中，將11個水樣抽好之后將盛有濾膜的的比色管放入-20冰柜中放置24h。取90%乙醇溶液（330ml 95%乙醇+14.5ml純水）放置85水浴鍋中預(yù)熱，預(yù)熱充足后取出樣品立即加入熱乙醇使其充分浸沒濾膜，85水浴2min，之后放置到室溫避光處，萃取4h，將萃取液定容到25ml，混勻。用90%乙醇調(diào)零測定溶液在665nm與750nm下吸光度。記錄OD值。再根據(jù)計算公式： Chla=27.9V乙醇(E665-E750)-(A665-A750)/V樣品計算出葉綠素a含量。其中Chla指葉綠素a濃度（mg/mL），V乙醇是萃取液定容的體積，V樣品是過

10、濾水樣的體積。1.2水體環(huán)境環(huán)境的尋優(yōu)水體環(huán)境的因子有很多，但是最主要的有以下幾種，溫度，ph,鹽度，等幾種主要因素，為了尋找上述因子的最優(yōu)組合，采用正交試驗的方法，分別將溫度設(shè)置為20，15,10；鹽度設(shè)置為30，35，40；ph設(shè)置為6.5,7.0.8.0。判斷的方法是實驗結(jié)束后，海參的生長總量，以及平均生長總量，本實驗采用L934正交表實驗方案如下。因素水平溫度ph鹽度實驗結(jié)果實驗一206.030實驗二207.035實驗三208.040實驗四156.040實驗五157.030實驗六158.035實驗七106.035實驗八107.040實驗九108.0302海參的加工利用海參的加工利用的主

11、要方法是直接食用，又由于海參離開海水會自溶，所以必須盡快加工以便流通。市場上流通的海參大多是干制品，所采用的干燥脫水方法主要還是傳統(tǒng)的蒸煮、掛鹽、晾曬等手段，急需新型的干燥脫水加工技術(shù)。2.1當前主要海參加工技術(shù)海參罐頭將熟化的海參真空或充氮包裝10 ，或?qū)⒑⒓皽b瓶或罐，經(jīng)高壓滅菌，密封后冷藏，但湯汁易使海參體壁破碎，出現(xiàn)渾濁，保質(zhì)期短。其特點是海參經(jīng)高壓后組織松軟，易于消化吸收。保留了鮮海參的原汁原味，營養(yǎng)成分流失少，口感較好。經(jīng)高溫滅菌，真空包裝，可長期冷藏儲存，但不符合人們的使用習(xí)慣，另外高溫加工使的很多活性成分被破壞，且需要添加防腐劑。海參(含參腸、參卵等)膠囊加工方法一般有以下

12、幾種11，一是用凍干、烘干、氣流、超微粉碎等方法制得海參干粉膠囊的干燥粉碎法;二是活化凍干法，鮮海參(含參腸、參卵)經(jīng)酶解活化，低溫凍干后制得海參干粉膠囊。此工藝最大限度地保留了海參的營養(yǎng)和活性成分，于吸收，便于攜帶，但成本、價格非常高;三是提取凍干法，提取分離海參多糖等活性成分凍干后制成膠囊。因其設(shè)備和技術(shù)要求高，產(chǎn)量有限，使得產(chǎn)品的成本、價格亦高。將海參制成膠囊后，完全喪失了海參原有的風(fēng)味和口感。2.2液體海參即“海參口服液”12，從理論上講，液體海參是最佳補品，它幾乎完整地保留了海參的營養(yǎng)和活性成分，利用率達 90% 以上，易于消化吸收，特別適合重病、手術(shù)后、消化功能不良的患者。但失去海

13、參原形后不容易被消費者接受。2.1海參加工廢液的回收使用2.1.1有機溶劑萃取法海參加工后的廢液中含有海參皂苷，海參皂苷在抗癌，抑制腫瘤上具有很神奇的作用14,海參加工利用后的廢液中含有一定量的海參皂苷，目前采用的提取方法主要有乙醇或甲醇等有機溶劑的萃取法15 具體方法是。海參加工廢液浸 噴霧干燥 粉末 75%乙醇 浸提液 減壓濃縮，水復(fù)溶，過濾 濾液 乙酸乙酯萃取水層 正丁醇萃取 正丁醇層 加壓濃縮，熱無水乙醇溶解過濾 濾液 冷析，過濾 ,真空干燥 海參皂苷2.1.2 大孔吸附樹脂法除了有機溶劑法之外,還可以采用大孔樹脂法16，具體方法是，海參廢棄液用 1 mol/ L NaOH 調(diào)節(jié) pH

14、 = 10 ,離心(8 000 r/ min ,30 min) 收集上清液 ,上樣于預(yù)處理的AB28 型大孔吸附樹脂柱 ,用去離子水沖洗后 ,分別用20 %和 70 %的乙醇溶液進行洗脫 ,收集 70 %乙醇的洗脫組分 ,減壓濃縮至浸膏狀 ,加入少量蒸餾水重新溶解 ,離心(8 000 r/ min ,40 min)收集上清液 ,經(jīng)石油醚萃取脫脂后 ,將水層再利用水飽和的正丁醇萃取 3 次 ,合并所得正丁醇層 ,減壓濃縮至浸膏狀后進行真空冷凍干燥 ,即得到水溶性海參皂苷凍干品。3 海參餌料自制海參主要攝食泥沙中的單細胞藻類、原生動物、細菌、海藻碎片、有機碎屑和腐殖質(zhì)等; 在養(yǎng)殖過程中, 也有用海

15、藻粉、地瓜粉、雜魚蝦粉、麩皮以及刮取富有底棲硅藻的海泥等喂養(yǎng)海參17。對海參餌料的研究最早是日本，有人曾經(jīng)無色鞭毛蟲作為刺參幼體的餌料，此后 ,小天和山本等先后用單鞭金藻、角毛藻、底棲硅藻和人工配合飼料等進行稚幼參的培育 ,但稚參至幼參的成活率很低18.因此研發(fā)效率高的自制餌料迫在眉睫，由于海參生長的海洋環(huán)境中鹽度較高，所以從海泥或者海參內(nèi)臟中篩選耐鹽微生物，作為海參的餌料是增加海參經(jīng)濟價值的重要方法。微生物的篩選可以通過創(chuàng)造含鹽量較高的選擇培養(yǎng)基19 20，來達到富集篩選的作用。3.1耐鹽微生物的篩選3.1.1實驗材料和儀器菌種分離和富集培養(yǎng)采用 RM 培養(yǎng)基(gL ):NaCl 250.

16、0, 無水MgSO4 9.7, 檸檬酸鈉 3.0, KCl2.0, 無水CaCl2 0.2, 細菌蛋白胨(L 37)10,pH7.0固體培養(yǎng)基加瓊脂15. 1 L 培養(yǎng)基含 NaCl 500 g，無水 MgSO49,7 g，檸檬酸鈉 3.0 g，KCl 20 g，無水 CaCl202 g，細菌蛋白胨 100 g，酵母抽提物 20 g，pH 7,5 固體培養(yǎng)基加瓊脂 15 g，121滅菌 15 min，保存?zhèn)溆?電熱恒溫干燥箱(PH050，上海實驗儀器廠)、電子天平(PL203METTLER TOLEDO 公司)、恒溫搖床(ZD-85，上海精達公司)、恒溫培養(yǎng)箱(ZHWY-100B，上海智城公司

17、)、無菌操作臺(上海博訊公司)、754 紫外分光光度計3.1.2實驗方法將海泥加入無菌水中，離心取上清的水樣，將水樣直接加到液體培養(yǎng)基中(1100)，37、120 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)3 d 取培養(yǎng)基10l，稀釋(1000)后涂布平板，37恒溫培養(yǎng)，依據(jù)菌落形態(tài)(形狀、大小、顏色及表面特征)，挑取單菌落反復(fù)劃線純化3 4 次，將最后一次挑取的單菌落接入液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng) 12 h，10% 甘油，20凍存?zhèn)溆迷赗M固體培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法在光鏡下觀察菌體形態(tài)3.2海參內(nèi)臟中微生物的分離純化與鑒定海參內(nèi)臟中的微生物的分離純化與鑒定，其主要的目的是通過研究海參內(nèi)臟中微生物的種

18、類和數(shù)量，來探索海參的自然食物鏈，為制造人工餌料提供基礎(chǔ)信息。3.2.1 實驗材料和儀器海參內(nèi)臟從市面上直接購買新鮮的海參，培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、金氏培養(yǎng)基B21 ，儀器同上3.2.2 實驗方法和步驟選取健康海參6只，殺死后放入75% 的酒精中浸泡 10 s，在無菌操作臺下取出海參并放在 01% 升汞液中消毒兩分鐘，移入滅菌水中清洗，然后在蠟盤中進行無菌解剖。分別取出其內(nèi)臟，在滅菌研缽中研磨。將研磨液用無菌水稀釋至 10-110-8。取10-6、10-7、10-8三個稀釋度用平板稀釋法和涂布法進行分離，各稀釋度重復(fù)3 次，分別置于 30 培養(yǎng)箱和YQX 型厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

19、 72 h，各挑取表征各異的菌落在 NA 平板上劃線、純化、培養(yǎng)。將純化后菌落再分別移植斜面培養(yǎng)，并按出現(xiàn)數(shù)量多少依次編號。12 2腸道細菌的鑒定將蠐螬腸道中分離純化的各細菌菌株的菌體進行形態(tài)染色，觀察培養(yǎng)性狀并測試生理生化指標，按照有關(guān)文獻進行鑒定22 2324。4 海參集約化增養(yǎng)殖的工程化探索論證海參室內(nèi)養(yǎng)殖的的可行性，建立生態(tài)養(yǎng)殖模式，第二部分 可行性分析本課題在福州大學(xué)天然產(chǎn)物與中藥現(xiàn)代化研究所及生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗中心公共實驗室進行。四、本課題的特色與創(chuàng)新之處1、利用自制餌料和市面上銷售的海參飼料進行對比。2、海參生態(tài)化養(yǎng)殖。五、參考文獻1段續(xù)，王輝，任廣躍，等.海參干制技術(shù)及其研

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