1、第14部分遺傳密碼和遺傳信息的翻譯系統(tǒng)教學(xué)知識(shí)三聯(lián)密碼的證實(shí)。1961年Crick和Brenner.S等證實(shí)了三聯(lián)密碼的真實(shí)性。他們用T4染色體上的一個(gè)基因（r位點(diǎn)）通過(guò)用原黃素（proflavin）處理，可以使DNA脫落或插入單個(gè)堿基，插入叫“ 加字”突變，脫落叫“ 減字”突變.無(wú)論加字和減字都可以引起移碼突變。Crick小組用這種方法獲得一系列的T4“加字”和“減字”突變，再進(jìn)行雜交來(lái)獲得加入或減少一個(gè)，二個(gè)，三個(gè)的不同堿基數(shù)的系列突變。它們只能在B菌株上生長(zhǎng)形成噬菌斑開(kāi)始用原黃素誘導(dǎo)的突變稱FCO，他們?cè)儆迷S素誘導(dǎo)產(chǎn)生回復(fù)突變，在E.coli K（）菌株中出現(xiàn)了噬菌斑。用遺傳學(xué)的方法和

2、野生型雜交發(fā)現(xiàn)它們并不是真正的野生型。校正突變（A suppressor mutation）抵消或抑制了前一次突變的效應(yīng)，校正突變的特點(diǎn)如下：(1) 校正突變是在第一次突變不同位點(diǎn)將它抵消的。因此原來(lái)的突變可以通過(guò)野生型和回復(fù)突變型之間的雜交又恢復(fù)為突變型； (2) 校正突變可能發(fā)生相同的基因中，抑制原來(lái)的突變（如剛舉的例子），稱基因內(nèi)抑制，或發(fā)生在不同的基因中稱基因外抑制。 (3) 不同的抑制可能作用的方式不同。如有的抑制是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，有的可能是通過(guò)細(xì)胞生理功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。三.利用突變來(lái)解讀密碼1960 A. Tsugita,H.Fraenkel-Connrat小組和H.G. Wittma

3、nn小組試圖通過(guò)用亞硝酸來(lái)對(duì)TMV進(jìn)行誘變。當(dāng)時(shí)根據(jù)亞硝酸誘變的原理，mRNA中的AG或CU的緣故。當(dāng)時(shí)已搞清了TMV肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)由158個(gè)氨基酸組成，將突變型和野生型進(jìn)行比較就能確定肽鏈上氨基酸取代的位點(diǎn)和類(lèi)型。四.無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的建立1961年Nirenberg建立了無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)這一新技術(shù)又是在多核苷酸磷酸化酶發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。1955 S.Ocha在細(xì)菌中分離了多核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase）,它催化核糖核苷二磷酸的聚合，它不需要任何DNA模板就可合成.他們的方法是: (1) 去模板：用DNAase處理E.coli抽提物，使DNA降解，除去原

4、有的細(xì)菌模板。 (2) 加入pol U：合成了多聚苯丙氨酸，這一結(jié)果不僅證實(shí)了無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的成功，同時(shí)還表明UUU是苯丙氨酸的密碼子。分別加入polyA，polyC 和polyG 結(jié)果相應(yīng)地獲得了多聚賴氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。 (3) 按比例加入種核苷混合的多聚物由于當(dāng)時(shí)還未分離RNA pol酶，無(wú)法按設(shè)計(jì)的模板來(lái)合成RNA，Nirenberg又想出了一種新的方法，就是按一定的堿基比例來(lái)合成RNA。比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，堿基比為U：G5：1，它們能組成8種三聯(lián)體： UUU，UUG，UGU，GUU， GGG，GGU，GUG，UGG。U和G將隨機(jī)地加入到三聯(lián)體中，這樣按比例

5、各個(gè)位于上進(jìn)入U(xiǎn)和G 的概率不同，。如氨基酸測(cè)定結(jié)果：如UUU：UGG（555）:（511） 25 ： 1同理UUU：UUG 5 ：1，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果推測(cè):苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU） 5 ： 1苯丙氨酸（UUU）：纈氨酸（GUU） 5 ： 5苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GUU） 24 ： 1五.三聯(lián)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)1964年Nirenberg又采用三聯(lián)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(1) tRNA和氨基酸及三聯(lián)體的結(jié)合是特異的；(2) 上述結(jié)合的復(fù)合體大分子是不能通過(guò)硝酸纖維濾膜的微孔，而tRNA- 氨基酸的復(fù)合體是可以通過(guò)的。六. 利用重復(fù)共聚物破譯密碼Khorara 采用了有機(jī)合成一條短的單鏈DNA重復(fù)順

6、序，然后用DNA pol 1合成其互補(bǔ)鏈，再用RNA pol及不同的底物合成兩條重復(fù)的RNA共聚物（圖143），作為翻譯的mRNA ，加入到體外表達(dá)系統(tǒng)中，第二節(jié) 遺傳密碼的證實(shí)和特點(diǎn)一. 遺傳密碼的證實(shí)1966年Sterisinger等用噬菌體T4證實(shí)了遺傳密碼是完全正確的。他們采用的方法跟Crick的原黃素誘發(fā)移碼突變的方法相同，使T4溶菌酶產(chǎn)生了移碼突變，根據(jù)突變后的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和野生型溶菌酶氨基酸順序進(jìn)行了比較，二遺傳密碼在纖毛蟲(chóng)和線粒體中的改變一. 遺傳密碼的特點(diǎn)(1) 遺傳密碼是三聯(lián)體密碼。(2)遺傳密碼無(wú)逗號(hào)。(3)遺傳密碼是不重迭的。(4)遺傳密碼具有通用性。(5)遺傳密碼具

7、有簡(jiǎn)并性(degeneracy (synonyms)。(6) 密碼子有起始密碼子和終止密碼子。(7) 反密碼子中的“ 擺動(dòng)”（wobble）表示第三個(gè)堿基擺動(dòng)的模式。在八成員組成的密碼子家族中，每個(gè)成員的四個(gè)密碼子意思相同，那么第三個(gè)堿基U、C、A、G對(duì)氨基酸起不到特異的作用。在七個(gè)成員組成的密碼子的意思相同。第三個(gè)堿基都是Py，含U或C。在五個(gè)成員組成的密碼子家族中，每個(gè)成員的二個(gè)密碼子都是相同的，第三堿基都是Pu，含A或G 。由一個(gè)成員組成的密碼子家族中，有3個(gè)密碼子的意思相同，第三個(gè)堿基含有U、C和A。擺動(dòng)假說(shuō)(wobble hypothesis)是由Crick.F（1966年）提出的。

8、即當(dāng)tRNA的反密碼子與mRNA的密碼子配對(duì)時(shí)前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)法則，但第三對(duì)堿基有一定的自由度可以“擺動(dòng)”。擺動(dòng)假說(shuō)也稱為三中讀二（2 out of 3 reading）。三中讀二一般可分為三種情況：(1) 第,兩個(gè)堿基形成個(gè)氫鍵時(shí)，可三中讀二。 如，和。(2) 第1 ,2兩個(gè)堿基形成4個(gè)氫鍵時(shí),不可三中讀二。 如AAX，X 和。(3) 第，兩個(gè)堿基形成個(gè)氫鍵時(shí), 當(dāng)?shù)诙€(gè)堿基為嘧啶時(shí)，可三中讀二； 如，和。 當(dāng)?shù)诙€(gè)堿基為嘌呤時(shí)則不能三中讀二， 如， ，和X。第三節(jié) tRNA的結(jié)構(gòu)和功能 一. tRNA的結(jié)構(gòu) （一）三葉草型的二維結(jié)構(gòu)(1)各種tRNA均含有7080個(gè)堿基，其 中2

9、2個(gè)堿基是恒定的。(2) 5端和3端配對(duì)（常為7bp）形成莖區(qū)，稱為受體臂（acceptor arm）或稱氨基酸臂 。在3端永遠(yuǎn)是4個(gè)堿基（XCCA）的單鏈區(qū)，在其末端有2-OH或3-OH，是被氨基?；稽c(diǎn)。此臂負(fù)責(zé)攜帶特異的氨基酸。 （3）TC常由5bp的莖和7Nt和環(huán)組成。此臂負(fù)責(zé)和核糖體上的rRNA 識(shí)別結(jié)合； (4)反密碼子臂(anticodon arm)常由5bp的莖區(qū)和7Nt的環(huán)區(qū)組成，它負(fù)責(zé)對(duì)密碼子的識(shí)別與配對(duì)。 (5)D環(huán) (D arm)的莖區(qū)長(zhǎng)度常為4bp，也稱雙氫尿嘧啶環(huán)。負(fù)責(zé)和氨基酰tRNA聚合酶結(jié)合; (6)額外環(huán)(extra arm)可變性大，從4 Nt到21 Nt不

10、等，其功能是在tRNA的L型三維結(jié)構(gòu)中負(fù)責(zé)連接兩個(gè)區(qū)域（D環(huán)反密碼子環(huán)和TC-受體臂）。 （二） tRNA的三維結(jié)構(gòu) 酵母苯丙氨酸t(yī)RNA的三級(jí)氫鍵tRNA 的堿基 堆積L型結(jié)構(gòu)(2)D環(huán)和TC環(huán)形成了“ L” 的轉(zhuǎn)角。(1)氨基酸受體臂位于L型的一側(cè)，距反密碼子環(huán)約70 A(3)在一些保守和半保守的堿基之間形成很多的三級(jí)氫鍵,使分子形成L形b,并使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。(4)使得三維結(jié)構(gòu)得以形成的這些堿基配對(duì)涉及到與磷酸核糖主鏈相互作用的三級(jí)結(jié)構(gòu)的磷酸二酯鍵分布在核糖的2-OH上。(5)幾乎所有的堿基平面之間產(chǎn)生堆積的作用。(6)在反密碼子莖中僅有很少的三級(jí)氫鍵。二.校正tRNA抑制基因（suppres

11、sor）或稱校正基因 （一）無(wú)義抑制（nonsense suppressor） 1. tRNA反密碼子的突變 2. tRNA其它結(jié)構(gòu)的改變 （二）錯(cuò)義抑制抑制突變的特點(diǎn): 1.不是所有抑制基因都能產(chǎn)生有功能的蛋白質(zhì)，關(guān)鍵是要看氨基酸取代的情況。 2. 校正的作用不可能是完全的。 校正的tRNA分子是有限的而且還要和釋放 因子競(jìng)爭(zhēng)； 若是錯(cuò)義抑制的話，由于氨基酸發(fā)生取 代,使得蛋白質(zhì)的活性有所降低。 3. 每種抑制tRNA一般都只識(shí)別UAG終止密碼子，而不再識(shí)別原來(lái)相應(yīng)的密碼子。4.赭石突變抑制基因不僅可以識(shí)別赭石密碼子（UUA），也可以抑制琥珀突（Am）碼子UAG。但反過(guò)來(lái)Am抑制基因（CUA

12、）就不能抑制赭石突變（UAA），這是由于擺動(dòng)緣故所造成。5. 當(dāng)細(xì)胞中含有多個(gè)tRNA拷貝時(shí)，抑制才能發(fā)揮作用。6. 有的抑制基因，不僅可以識(shí)別終止密碼子，而且還可以識(shí)別原來(lái)的密碼子。如野生型tRNATrp的反密碼子是CCA，它可以識(shí)別原來(lái)的密碼子UGG，而且還可以識(shí)別終止密碼子UGA。7.校正基因一般不會(huì)影響正常的終止(1)校正基因識(shí)別的終止密碼子不一定和正常終止的密碼子相同。有時(shí)正常終止位點(diǎn)有兩個(gè)連續(xù)的終止密碼子，而且結(jié)構(gòu)不同，如UAG-UAA；(2)釋放因子將和抑制基因競(jìng)爭(zhēng)和終止密碼子的結(jié)合；(3)抑制基因的效率很低，通常為15%，所以常不會(huì)抑制正常終止。三. tRNA對(duì)氨基酸的識(shí)別（1

13、） tRNA怎樣接受特定的氨基酸， 氨基酰 tRNA合成酶怎樣識(shí)別tRNA；（2） tRNA中的哪些結(jié)構(gòu)和接受特定氨 基酸有關(guān)。1988年Hou Ya-ming（候雅明）和Schimmel首先取得突破。他們采用的方法是： (1) 選用E.coli (trp-)來(lái)進(jìn)行研究； (2) tRNA，攜帶Ala，反密碼子突變成CUA，可以 和終止密碼子UAG相配對(duì),可校正色氨酸的琥 珀突變. (3) 用點(diǎn)突變的方法來(lái)改變校正tRNA（Ala）上的 各個(gè)位點(diǎn)，觀察對(duì)識(shí)別Ala有何影響，他們證明 了Ala tRNA的G3:U70堿基對(duì)，僅一對(duì)堿基決定了 丙氨酰tRNA合成酶與tRNA的識(shí)別。這種小元件稱為tRNA的“ identity”，或稱為副密碼子（paracodon）。表14-7 原核和真核生物核糖體的組成及功能核糖體亞基 rRNAs 蛋白 RNA的特異順序和功能 細(xì)菌 70S 50S 23S=2904b 31種(L1-L31）含CGAAC和GTCG互補(bǔ)2.5106D 5S=120b66%RNA 30S 16S=1542b 21種(S1-S21) 16SRNA(CCU