1、第09章干細胞術(shù)第一節(jié) 干細胞概述 干細胞（stem cells）是一類未分化的或原始的、具有自我更新能力（self-renewing）的多潛能細胞，在一定條件下，可以分化成機體內(nèi)的多功能細胞，形成任何類型的組織和器官，以實現(xiàn)機體內(nèi)部構(gòu)建和自我康復(fù)能力。干細胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機制和微環(huán)境因素的影響。 目前，人類胚胎干細胞可成功地在體外培養(yǎng)，成體干細胞可以橫向分化為其他類型的細胞和組織，為干細胞的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 一、干細胞的分類與來源 （一）干細胞的分類 1按照生存階段分類 干細胞可分為胚胎干細胞（ESC）和成體干細胞（ASC）。 胚胎干細胞包括胚胎干細胞和胚胎生殖細胞（EGC）。 成體干細胞

2、包括骨髓間充質(zhì)干細胞（MSC）、血液干細胞（HSC）、表皮干細胞和神經(jīng)干細胞（NSC）等。 2按分化潛能分類 干細胞可分為全能干細胞、胚胎干細胞、多能干細胞和單能干細胞 （1）全能干細胞：具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細胞，具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)特征和很強的分化能力，可以無限增殖并分化成為全身200多種細胞類型，進一步形成機體的所有組織、器官，最終發(fā)育成一個完整的個體。受精卵就是一個最初始的全能干細胞。 （2）多能干細胞：具有分化出多種細胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。骨髓多能造血干細胞是典型的例子，它可分化出至少十二種血細胞，但不能分化出造血

3、系統(tǒng)以外的其它細胞。 （3）單能干細胞：也稱專能、偏能或定向干細胞，只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化，如上皮組織基底層的干細胞，肌肉中的成肌細胞或衛(wèi)星細胞。 （二）干細胞的來源 1胚胎干細胞 可來源于畸胎瘤細胞、桑椹球細胞、囊胚內(nèi)細胞團、擬胚體細胞、生殖原基細胞等。 ESC是在人胚胎發(fā)育早期囊胚（受精后57d）中未分化的細胞。囊胚含有約140個細胞，外表是一層扁平細胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細胞群，稱內(nèi)細胞群，這些未分化的細胞可進一步分裂、分化，發(fā)育成個體。將內(nèi)細胞團分離出來進行培養(yǎng)，在一定條件下，這些細胞可在體外“無限期”地增殖傳代

4、，同時還保持其全能性，因此被稱為ESC。胚胎干細胞具有全能性，可以自我更新并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。 2成體干細胞 成年動物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力。在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新的干細胞，或者按一定的程序分化形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。 成體干細胞可以由下列幾個方面得到： 胚胎細胞由ESC定向分化或移植分化而成。 胚胎組織由分離胚胎組織、細胞分離或培養(yǎng)而成。 成體組織由臍血、骨髓、外周血、骨髓間質(zhì)和脂肪細胞等得到。 二、干細胞的應(yīng)用研究 1胚胎干細胞育出心臟組織 以色列科學(xué)家從胚胎干細胞培養(yǎng)出的人類心臟組織，可以自然

5、跳動，并且有新生心臟組織的電特性和機械性。實驗證明，以細胞移植治療心臟病是可能的。德國醫(yī)生使用病人自身的干細胞治療心肌梗塞取得了可喜的成果。 2骨髓干細胞育出腎臟組織 英國科學(xué)家用骨髓干細胞培育出了腎臟組織，這在器官移植手術(shù)中是一個重大突破，醫(yī)生可通過修補受損腎臟達到治療的目的。同時，也證明了成人骨髓干細胞可以發(fā)育成成熟的腎臟細胞。 3臍血干細胞 由干臍帶血和胎盤含有大量的干細胞，因而受到越來越多的重視和利用。1979年，醫(yī)學(xué)界首次發(fā)現(xiàn)臍帶血中含有恢復(fù)白血病患者造血功能的細胞。自1998年以來，從胎盤和臍帶血中提取出來的血液，已挽救了數(shù)百人的生命。 4皮膚干細胞 我國研究人員發(fā)現(xiàn)，人體燒傷皮膚

6、原位處存在著皮膚干細胞，利用它在一定藥劑調(diào)控下，能使燒傷的皮膚原位再生，修復(fù)如初。這是我國在皮膚干細胞研究及其臨床應(yīng)用上的重大突破。 5胰島干細胞 美國Ramiya等從尚未發(fā)病的糖尿病小鼠胰島導(dǎo)管中分離出胰島干細胞，在體外誘導(dǎo)分化成產(chǎn)生胰島素的細胞。實驗表明，接受移植的糖尿病鼠血糖濃度控制良好，而對照組小鼠死于糖尿病，為干細胞治療糖尿病奠定了實驗基礎(chǔ)。 6神經(jīng)干細胞 由于分離神經(jīng)干細胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細胞研究尚存在爭議，神經(jīng)干細胞的研究仍處于初級階段。腦和脊髓由于血腦屏障的存在，使之在干細胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，如給帕金森綜合癥患者的腦內(nèi)移植含有多巴胺生成

7、細胞的神經(jīng)干細胞，可緩解部分患者癥狀。 三、干細胞應(yīng)用平臺技術(shù) 1技術(shù)原理 細胞分化過程中，往往由于高度分化而完全失去再分裂的能力，最終衰老死亡。機體在發(fā)展適應(yīng)過程中為了禰補這一不足，保留了一部分未分化的原始細胞，稱為干細胞。一旦生理需要，這些干細胞可按照發(fā)育途徑通過分裂而產(chǎn)生分化細胞，即干細胞充當(dāng)了分化細胞“預(yù)備隊”的角色。在動物體內(nèi)，多數(shù)組織含有干細胞，甚至在進化的早期，最初級的后生動物海綿也含有稱之為“始祖母細胞”的干細胞。 （1）干細胞的特點：干細胞本身不是處于分化途徑的終端。干細胞能無限的增殖分裂。干細胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)。 （2）干細胞的分裂方式：一是對稱

8、分裂，形成兩個相同的干細胞。二是非對稱分裂，由于細胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，使得一個子細胞不可逆的走向分化的終端成為功能專一的分化細胞；另一個保持親代的特征，仍作為干細胞保留下來。分化細胞的數(shù)目受分化前干細胞的數(shù)目和分裂次數(shù)控制?？梢哉f，干細胞是具有多潛能和自我更新特點的、增殖速度較緩慢的細胞。 2技術(shù)方向 凡需要不斷產(chǎn)生新的分化細胞和分化細胞本身不能再分裂的細胞或組織，都要通過干細胞所產(chǎn)生的具有分化能力的細胞來維持機體細胞的數(shù)量。生命體是通過干細胞的分裂，實現(xiàn)細胞的更新而保證持續(xù)生長。隨著基因工程、胚胎工程、細胞工程等生物技術(shù)的發(fā)展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養(yǎng)干細胞已成為可

9、能，利用干細胞構(gòu)建各種細胞、組織、器官作為移植器官的來源，將成為干細胞應(yīng)用的主要方向。 3技術(shù)突破 一是人類胚胎干細胞在體外培養(yǎng)成功。1998年，James Thomson和John Gearhart從人囊胚的內(nèi)層細胞團中取得胚胎干細胞，將胚胎干細胞與小鼠的骨髓間質(zhì)細胞進行共培養(yǎng)，結(jié)果表明胚胎干細胞可以進行長達5個月的非分化增殖，同時還保持著分化為滋養(yǎng)層組織及三種胚層組織的能力，為胚胎干細胞的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。另一個重大突破是成體干細胞的橫向分化。1999年，Goodell等用肌肉來源的干細胞在小鼠體內(nèi)分化成各種血細胞，這表明成體干細胞在一定的微環(huán)境作用下，可以橫向分化為需要的細胞和組織，從而起

10、到極為有效的治療作用。 4干細胞的分離與純化 體外干細胞分離的方法，首先是從已被證明含有干細胞的胚胎或成年哺乳動物的器官中取材，然后將所取的組織進行解離分散，最后將已分離的細胞暴露于含有高濃度促細胞分裂劑的培養(yǎng)基中，經(jīng)過一定數(shù)量的增殖后，撤消促細胞分裂劑而誘導(dǎo)細胞進行分化（如向神經(jīng)元方向分化），或把細胞暴露于其它因子中使其中的一些細胞發(fā)育為不同的細胞系。 5干細胞的體外培養(yǎng) 由于干細胞的數(shù)目很少，需要在體外對干細胞進行非分化性增殖。這需要許多生長因子和間質(zhì)細胞的共培養(yǎng)。Brustle等在體外成功地培養(yǎng)了鼠的表皮干細胞，首先把分離的表皮干細胞在含有成纖維細胞因子2（FGF-2）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨

11、后加入上皮生長因子（EGF），最后在FGF-2和血小板源性生長因子（PDGF）的混合培養(yǎng)基中生長增殖。在這種培養(yǎng)條件下，表皮干細胞可以保持其分化潛能，如停止供給生長因子，表皮干細胞會分化為寡樹突細胞或星狀細胞。不同組織來源的干細胞的培養(yǎng)條件不盡相同。在應(yīng)用前還需依據(jù)靶組織類型對培養(yǎng)干細胞進行定向分化誘導(dǎo)。準(zhǔn)確的分化誘導(dǎo)是應(yīng)用干細胞治療的基礎(chǔ)，這需要對與干細胞發(fā)育有關(guān)的信號調(diào)節(jié)及微環(huán)境的影響進行詳細研究第二節(jié) 胚胎干細胞 胚胎干細胞（ESC）是在人胚胎發(fā)育早期囊胚（受精后57d）中未分化的細胞。囊胚含有約140個細胞，外表是一層扁平細胞，稱滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤等。中心的腔稱囊胚腔

12、，腔內(nèi)一側(cè)的細胞群，稱內(nèi)細胞群，這些未分化的細胞可進一步分裂、分化，發(fā)育成個體。內(nèi)細胞群在形成內(nèi)、中、外三個胚層時開始分化。每個胚層將分別分化形成人體的各種組織和器官。如外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等，中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織，內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。由于內(nèi)細胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，稱為ESC。 第三節(jié) 成體干細胞 越來越多的證據(jù)表明，ASC被移植入受體中能表現(xiàn)出很強的可塑性。通常情況下，供體的干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。而在某些情況下，干細胞的分化并不遵循這種規(guī)律。1999年，Goodell等分離

13、出小鼠的肌肉干細胞，體外培養(yǎng)后，與少量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化為各種血細胞系，這種現(xiàn)象被稱為干細胞的橫向分化。以造血干細胞為例加以說明。 造血干細胞(HSC)是體內(nèi)各種血細胞的唯一來源，它主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中。造血系統(tǒng)是體內(nèi)高度活躍和高度新陳代謝系統(tǒng)，HSC的基本特征是自我維持和自我更新，即通過不對稱性有絲分裂，在不斷產(chǎn)生大量祖細胞的同時，使自己不增殖也不分化。 由HSC到祖細胞再到外周血細胞的分化調(diào)節(jié)過程相當(dāng)復(fù)雜，依賴于各種造血生長因子、造血基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)等多種因素的相互作用與平衡，并涉及細胞的增殖分化、發(fā)育成熟、遷移定居、衰

14、老凋亡和癌變等生命科學(xué)中的許多基本問題，這也是基礎(chǔ)研究的主要熱點。 1造血干細胞的特點 首先，在個體發(fā)育過程中，HSC歷經(jīng)多次遷移，先由卵黃囊轉(zhuǎn)移到胎肝，最后到達骨髓，其后的某些條件下又可出現(xiàn)髓外造血的情況；而其它多能干細胞多在固定的場所發(fā)育成特定的組織。 其次，由于生理需要，HSC始終處于較為活躍的增殖與分化狀態(tài)，能從骨髓源源不斷地進入外周血而到達全身各處，而成熟個體中的多能干細胞多局限于相應(yīng)的組織器官中，一般情況下處于類似休眠的狀態(tài)。 第三，造血干細胞具有可塑性，可以分化為肝臟、肌肉及神經(jīng)等組織的細胞，一定條件下又可來源于肌肉干細胞、神經(jīng)干細胞等。 2骨髓庫 在臨床治療中，HSC應(yīng)用較早，

15、HSC移植就是應(yīng)用超大劑量化療和放療以最大限度殺滅患者體內(nèi)的白血病細胞，同時全面催毀其免疫和造血功能，然后將正常人的HSC輸入患者體內(nèi)，重建造血和免疫功能，達到治療疾病的目的。但是，造血干細胞移植需先進行人白細胞抗原（HLA）配型。 HLA是人體細胞表面的“主要組織相容性復(fù)合物”，只有兩個個體HLA配型相同，才能進行HSC移植，否則會發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)（GVHD）或移植排斥反應(yīng)，嚴(yán)重者可危及患者生命。 HLA由遺傳決定，理論上說，每五個同胞兄弟姐妹中可能有2人的HLA抗原完全相合，而在無血緣關(guān)系的人群中，約10萬人以上才可能有兩個HLA完全相同的個體。鑒于我國國情，在年輕患者的同胞中尋找HLA相合供體的可能性極小 由于HSC具有自我復(fù)制功能，捐贈骨髓一般不影響健康?，F(xiàn)在可通過HSC“動員”技術(shù)，采集分離約200毫升外周血而得到足夠數(shù)量的HSC，稱為外周血干細胞移植（PBSCT）。所謂骨髓庫，是抽取自愿者數(shù)毫升血用于HLA定型，并將資料儲存于電腦。有病人需要供體時，將其HLA資料經(jīng)電腦檢索配型，由配型相合者捐獻骨髓或外周血用于移植。 3、臍血庫 研究證明，臍帶血中含有豐富的HSC，