1、生物制品分析概論山東省藥品檢驗(yàn)所石峰 1、生物制品藥物分析有那些特點(diǎn)？2、為什么必須對生物制品進(jìn)行全程質(zhì)量控制？問題2第一節(jié) 概述化學(xué)藥物、生物藥物、中藥生物藥物（來源和生產(chǎn)方法）生化藥物生物合成藥物生物制品3生物藥物利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類藥物。4 生物藥物發(fā)展過程：第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質(zhì)與混合成分的粗提取物制劑：魚肝油、胰酶及其腸溶、甲狀腺粉及其制劑等。第二代：根據(jù)生物化學(xué)和免疫學(xué)原理，應(yīng)用近代生化分離純化技術(shù)從生物體制取的具有針對性治療作用的特異生化成分。如：

2、尿激酶、肝素鈉、胰島素、人血白蛋白等。第三代：應(yīng)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的天然生理活性物質(zhì)，以及通過蛋白質(zhì)工程原理設(shè)計(jì)制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物，或與天然物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的全新的藥理活性成分。如：重組人生長激素、重組人胰島素等。5生化藥物定義： 半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核甘酸類。6生物合成藥物定義: 由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物,如: 山梨醇、木糖醇、甘露醇、維生素、甾體激素、酶與輔酶類藥物等。7生物制品定義 用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工

3、程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。包括：細(xì)菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、細(xì)胞因子、體內(nèi)及體外診斷制品以及其他活性制劑 微生態(tài)制劑:雙歧桿菌 8生物制品的種類和特點(diǎn) 根據(jù)所采用的材料、制法或用途不同， 可分為六類:疫苗類藥物抗毒素及抗血清類藥物血液制品重組DNA制品診斷制品其他制品9疫苗類藥物定義:用病毒或立克次體接種于動(dòng)物、雞胚，或經(jīng)組織培養(yǎng)后加以處理制造。分類: （1）細(xì)菌類疫苗：由有關(guān)細(xì)菌、螺旋體或其衍生物制成的減毒活疫苗、滅活疫苗、重組DNA疫苗、亞單位疫苗等。如：皮內(nèi)注射卡介苗、吸

4、附破傷風(fēng)疫苗、乙型腦炎減毒疫苗、人用狂犬病疫苗等。 10 （2）減毒類疫苗：由病毒、衣原體、立克次體或其衍生物制成的減毒活疫苗、滅活疫苗、重組DNA疫苗、亞單位疫苗等。如：口服脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗 麻疹減毒活疫苗 風(fēng)疹減毒活疫苗 腮腺炎減毒活疫苗 重組乙型肝炎疫苗 甲型肝炎減毒活疫苗 流感全病毒滅活疫苗11 （3）聯(lián)合疫苗：指兩種或兩種以上疫苗原液按特定比例配合制成的具有多種免疫原性的滅活疫苗或活疫苗。如： 傷寒副傷寒甲乙聯(lián)合疫苗 吸附百白破聯(lián)合疫苗 麻疹腮腺炎聯(lián)合減毒疫苗 12 （4）雙價(jià)疫苗及多價(jià)疫苗：由單一型抗原成分組成的疫苗通稱單價(jià)疫苗。有兩個(gè)或兩個(gè)以上同一種但不同型抗原合并組成的含有雙

5、價(jià)或多價(jià)抗原成分的一種疫苗，則分別稱為雙價(jià)疫苗或多價(jià)疫苗。13抗毒素及抗血清類藥物 定義：凡用細(xì)菌類毒素或毒素免疫馬或其他大動(dòng)物所得的免疫血清叫抗毒素或抗毒血清。如： 破傷風(fēng)抗毒素 白喉抗毒素 肉毒抗毒素 凡用細(xì)菌或病毒本身免疫馬或其他大動(dòng)物所得 的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清。 如：抗蝮蛇毒血清 抗五步蛇毒血清 抗狂犬病血清14血液制品 定義：由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白成分，以及血液細(xì)胞有形成分統(tǒng)稱為血液制品。 如：人血白蛋白 人免疫球蛋白 人凝血因子15（二）生物制品的特點(diǎn)分子量不是定值。大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質(zhì)（如蛋白

6、質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等）。組分相同，但相對分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性，因此常需進(jìn)行相對分子量的測定。生化法結(jié)構(gòu)確證。由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用化學(xué)藥物或結(jié)構(gòu)已知的生化藥物所常用的方法，還需要生物化學(xué)分析如：氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等。16 需檢查生物活性 生物制品對熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏感，各種理化因素的變化易對生物活性產(chǎn)生影響。特別是多肽和蛋白質(zhì)。除理化分析，還需生物檢定，防止蛋白質(zhì)失活要求安全性檢查 物制品組分復(fù)雜，有效成分濃度很低，生物大分子雜質(zhì)含量比較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括：細(xì)胞外

7、源因子檢查、原液、半成品、成品中有關(guān)血清白蛋白殘留量、CHO細(xì)胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過敏試驗(yàn)、異常毒性檢查等。17 需做效價(jià)測定 對于生物制品有效成分的檢測，除應(yīng)有一般化學(xué)方法或理化分心進(jìn)行有效成分含量測定外，更應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特異生理效應(yīng)或?qū)Ｒ换磻?yīng)擬定其專屬性的生物效價(jià)測定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。例：人凝血酶原復(fù)合物的效價(jià)測定。18三、生物制品的全程質(zhì)量控制生物制品化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應(yīng)有嚴(yán)格要求，以生產(chǎn)出具有藥理活性高、針對性強(qiáng)、毒性低、副作用小，療效可靠及營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)的安全、高效的生物制品

8、。為此，必須進(jìn)行原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的全程質(zhì)量控制，以確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。19生物制品及檢定規(guī)程草案（1952年）生物制品制造檢定規(guī)程（1959年）中國生物制品規(guī)程（2000年）中華人民共和國藥典三部（2005年）中華人民共和國藥典三部（2010年）20藥典三部各論內(nèi)容品名定義、組成及用途基本要求制造檢定（原液、半成品、成品）保存運(yùn)輸及有效期使用說明（僅預(yù)防類含此項(xiàng)）21 生物制品品名定義、組成及用途基本要求制造檢定（原液、半成品、成品）保存運(yùn)輸及有效期使用說明（僅預(yù)防類含此項(xiàng)）化學(xué)藥品品名化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子式性狀鑒別檢查含量測定22 生物制品質(zhì)量控制重點(diǎn)有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證有效

9、成分的均一性、純度檢查有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)等的控制高效、靈敏的生物活性及比活性等實(shí)驗(yàn)方法 生物制品質(zhì)量控制基本方法 鑒別試驗(yàn) 雜質(zhì)檢查 安全性檢查 含量測定（生物活性或效價(jià)）23第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)依據(jù)生物制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特點(diǎn)，利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法進(jìn)行某些特殊反應(yīng)，或測定某些專屬的理化常數(shù)如紫外吸收系數(shù)、等電點(diǎn)、電泳遷移率、色譜保留時(shí)間和肽圖等，判斷與確證產(chǎn)品的真?zhèn)巍＃ㄒ唤M實(shí)驗(yàn)）24一、理化鑒別法1、化學(xué)鑒別法 利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。如胰島素的沉淀反應(yīng)。2、紫外分光光度法 蛋白質(zhì)生物制品主要由芳香族氨基酸側(cè)鏈如酪氨酸、色氨酸、苯丙

10、氨酸產(chǎn)生紫外吸收。如重組人促紅素最大吸收279nm。3、高效液相色譜法 （主峰保留時(shí)間和肽圖的一致性） 例如腦蛋白水解液 不同批次肽圖的一致性 25二、生化鑒別法1、酶法 利用酶對底物特異性的催化活力，做為酶類生物制品簡便、快速鑒別方法。如尿激酶的鑒別2、電泳法 等電點(diǎn)聚焦電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等?？捎糜诘鞍踪|(zhì)類生物制品的鑒別。 如重組人生長激素的鑒別： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 26三、 生物鑒別法（一）血清學(xué)法-體外抗原抗體試驗(yàn)抗原抗體類生物制品的鑒別 抗原抗體在體外結(jié)合時(shí)，可因抗原物理性狀不同或參與反應(yīng)的成分不同而出現(xiàn)各種類型的反應(yīng)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)給結(jié)合反應(yīng)，

11、即經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，又衍生出免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高度敏感的檢測技術(shù)。 27（二）生物學(xué)法利用生物體對生物制品特定的生物活性的反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行供試品的鑒別來鑒別藥物。例如: 小鼠驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素 肝素延長血凝鑒別肝素28第三節(jié) 雜質(zhì)檢查 可用來判斷藥品的優(yōu)劣。由于生物制品來自生物體，生物活性特特異性強(qiáng)，制造與純化工藝復(fù)雜，分子結(jié)構(gòu)常常不確定，有時(shí)產(chǎn)品并非單一，極微量雜質(zhì)可能產(chǎn)生顯著的效應(yīng)，因此，其雜質(zhì)檢查顯得尤為重要。主要包括： 一般雜質(zhì)檢查 特殊雜質(zhì)檢查 安全性檢查29 一般雜質(zhì)檢查 氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度、溶液的顏色、水份及

12、干燥失重、熾燒殘?jiān)?0一、特殊雜質(zhì)檢查 從原料中帶入或生產(chǎn)工藝中或貯藏過程中引入的雜質(zhì) 根據(jù)生物制品的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)與產(chǎn)品的穩(wěn)定性，其特殊雜質(zhì)分為：生物污染物：微生物污染、宿主細(xì)胞蛋白、外源性DNA、培養(yǎng)基成分等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：二聚體和多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、裂解產(chǎn)物等工藝添加劑：殘余抗生素、蛋白分離劑聚乙二醇、乙醇、佐劑氫氧化鋁，產(chǎn)品穩(wěn)定劑如辛酸鈉、肝素，防腐劑苯酚、硫柳汞，細(xì)菌與病毒滅活劑甲醛、戊二醛等。31（一）宿主細(xì)胞蛋白殘留量測定生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞、工程菌相關(guān)的特殊雜質(zhì)。方法：ELISA32（二）外源性DNA殘留量的檢查測定方法：分子雜交技術(shù)基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PC

13、R方法33（三）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢查生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存過程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結(jié)構(gòu)類似的同系物、異構(gòu)體、突變物、氧化物、聚合體或降解物。常用HPLC法和電泳法。如重組人生長激素中相關(guān)蛋白質(zhì)的測定 總相關(guān)蛋白質(zhì)含量不超過10%。34（四）殘余抗生素的檢查如果生物制品在生產(chǎn)過程中使用了抗生素，則不僅要在純化工藝中除去，而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測方法。常用方法：抑菌圈測量。結(jié)果判定：對照溶液有抑菌圈，陰性對照無抑菌圈，供試品溶液抑菌圈的直徑小于對照溶液抑菌圈的35二、安全性檢查（一）熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 法（二）異常毒性檢查（三）過敏試驗(yàn) 檢查異性蛋白（四）降壓試驗(yàn)

14、檢查組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓下降 的物質(zhì)（五）無菌試驗(yàn) 檢查藥品及敷料是否有活菌的一種方法36第四節(jié) 含量（效價(jià)）測定（一）含量測定表示方法： 百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解變成小分子的藥物測定方法：1、HPLC2、SDS（二）效價(jià)測定表示方法： 生物效價(jià)或酶活力：適用于酶類或蛋白質(zhì)類藥物。37一、理化分析法（一）滴定分析法 根據(jù)生物制品中某些成分能與標(biāo)準(zhǔn)溶液定量地發(fā)生酸堿中和反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)等特性，通過滴定進(jìn)行含量測定。如胰酶中胰脂肪酶的測定。以橄欖油為底物，經(jīng)胰脂肪酶水解后產(chǎn)生脂肪酸，用氫氧化鈉液滴定。38（二）光譜分析法1、比色法 例如：硫酸軟骨素的測定2、紫外分光光度

15、法 糜蛋白酶與底物N-乙酰-L-酪氨酸 237nm測定3、熒光分光光度法 反應(yīng)物或反應(yīng)產(chǎn)物激發(fā)產(chǎn)生應(yīng)觀熒光 應(yīng)用熒光試劑產(chǎn)生熒光 應(yīng)用另一酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生熒光39 （三）HPLC法特點(diǎn)：適合于對高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差 色譜柱：C8、C18 流動(dòng)相：甲醇-水（或緩沖液）、 乙腈-水 （或緩沖液） 檢測器：UV、熒光、ECD色譜條件：40高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）多肽及蛋白質(zhì)等生物藥物的分離及其分子量測定特點(diǎn)： 活性蛋白質(zhì)可以回收 流動(dòng)相通常為緩沖液，為改善分離，可加少量有機(jī)改性劑或表面活性劑 根據(jù)有效粒徑分離 41HPGFC測定rh-TNF衍生物的分子量色譜條件：色譜柱：SEC

16、-3000柱流動(dòng)相：2PO42SO4（1：1），內(nèi)加0.05%疊氮化鈉流速：1mL/min柱溫：檢測波長:280nm4243二、生化分析法 44（一）酶法酶法 酶活力測定法以酶為分析對象 酶分析法以酶為分析工具或分析試劑酶活力測定法酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。測定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度以單位時(shí)間底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。 酶活力45酶促反應(yīng)的影響因素（1）底物濃度的影響：選擇Km小的作底物 （2）pH的影響（3）溫度的影響：溫度控制在度（4）輔助因子的影響（5）空白和對照試驗(yàn) 空白：雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量 對照實(shí)驗(yàn)：用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測定。用 于比較或測定的標(biāo)準(zhǔn)。

17、46酶法測定方法（1）取樣測定法 停止酶反應(yīng)的方法：添加變性劑 加熱使酶失效（2）連續(xù)測定法 47檢測方法1、UV-VIS根據(jù)產(chǎn)物和底物特征吸收 差別2、熒光3、旋光法4、酶偶聯(lián)測定法 例如：ELASA5、其他：電化學(xué)法、離子選擇電極測定等 48（二）酶分析法以酶為分析工具的方法。分析的對象可以是酶的底物、輔酶活化劑或酶抑制劑。影響因素：酶和作用物的濃度、反應(yīng)時(shí)間、溫度和pH49（二）電泳法生物制品藥物分析的重要手段。在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移。1、自由界面電泳2、區(qū)帶電泳:紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、PAGE、SDS。3、HPCE：CZE、MECC、CGE、CIEF電泳原理電泳分類505152常用電泳法的類型和應(yīng)用 1、紙電泳法： （1）操作方法； （2）定量方法：同紙色譜 （3）應(yīng)用：蛋白質(zhì)、核苷酸類532、醋酸纖維素薄膜電泳應(yīng)用：血清蛋白、脂蛋白等的分離測定3、PAGE法 聚丙烯酰胺凝膠，分離效果取決于分子所帶電荷與分子大小的比例及分子篩效應(yīng)。 4、SDS法 測定酶和蛋白等大分子物質(zhì)分子量，蛋白分子相對遷移率的大小完全取決于分子量的高低，從已知