1、Neon-細胞電轉(zhuǎn)儀中文說明書(MPK)作者:日期:一，簡單的3步驟程序。.將收集到的細胞和待轉(zhuǎn)染的分子（例如DNA, RNA, siRNQ的混合物加入到提取物中o.將帶專用槍頭的移液器插入帶有電極杯的移液器座中;在設備上選擇程序，然后按開始。.拔下移液器，將轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到含有適當培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器 中。注：1.為了避免污染，強烈建議只使用電極杯10次。建議在切換到不同質(zhì)粒DNA / siRNA或細胞類型時更換電極杯和緩沖液 2.為了確保重復性和排除轉(zhuǎn)染條件的變化，建議不要使用槍頭超過2次二，軟件操作程序.按下電源開關（位于設備背面，第vii頁）打開Neon?設備。本 機檢查確保Neon?移液

2、器站已連接到設備，然后顯示啟動屏幕。.按Voltage啟動數(shù)字鍵盤輸入電壓值。按所需的電壓值，然后按Done保存該值。 注意：如果任何輸入值超出限制，則會顯 示錯誤信息，弁自動設置最小的限制值。.按Width激活數(shù)字鍵盤輸入寬度值。按所需的寬度值，然后按Done保存該值。.按Pulses激活數(shù)字鍵盤以輸入脈沖值。按所需的脈沖值，然后按Done保存該值。.如果要保存這些電穿孔參數(shù)，請按主屏幕上的“Save”將程序保存在數(shù)據(jù)庫中。.按所需的程序號碼編輯程序。選定的程序會突出顯示。.顯示“Edit”屏幕后，按鍵盤按鈕輸入用戶名。 光標自動移動 到下一個字段協(xié)議，弁突出顯示為紅色。繼續(xù)輸入Vo代age

3、,Width 和Pulses信息。8。按Enter鍵將信息保存在數(shù)據(jù)庫中。9.繼續(xù)準備細胞和DNA,弁設置用于電穿孔的移液器座三，細胞與DNA混合物準備注意事項：.將純化的DNA重懸于1-5g/L濃度的去離子水或TE緩沖液 (10mM TrisHCl, 1mM EDTA pH8.0)中。濃度可能因細胞類型而異。.DNA量不應超過使用總體積的 10%。.通過測量A 260/280比例來檢查純化的 DNA制劑的純度。電穿孔的比例應至少為1.8。.該裝置已經(jīng)用4-7kb質(zhì)粒進行常規(guī)測試，質(zhì)粒高達約20kb不應該是問題。使用大于20 kb的質(zhì)粒很可能降低轉(zhuǎn)染效率。.不要用乙醇沉淀DNA以濃縮DNAo通

4、過乙醇沉淀的濃縮 DNA 顯示差的轉(zhuǎn)染效率和由于鹽污染導致的細胞活力。.不含Ca2用口 Mg2 +的D-PBS或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS （第40 頁）流程:1.用3 mL電解緩沖液（使用緩沖液 E, 10 H LNeon?Tip和BufferE2, 100 LNeon?Tip）填充電轉(zhuǎn)杯。（確保管子側(cè)的電極完全浸入緩沖液中。）2.將電極杯插入移液器座，直到聽到咔嗒聲確保Neon?管的側(cè)面電極與Neon?移液器站的側(cè)球柱塞良好連接（見下圖左側(cè)正確位置）.在電穿孔前一天，將細胞轉(zhuǎn)移到具有新鮮生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶 中，使得細胞在實驗當天為 70-90%匯合。.對于大多數(shù)優(yōu)化協(xié)議，每10 H LNeon

5、?Tip可提供5X 104-2 x 105 個細胞。（5X 105-2X 106個細胞每100 cLNeon?Tip適用于大多數(shù) 優(yōu)化的方案。）.將含有血清，PBS（不含Ca2麗Mg2 +）和胰蛋白酶/ EDTA溶 液的培養(yǎng)基的等分試樣預溫至37 C。從培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)基，弁使用PBS不含Ca2林口 Mg2 +）沖洗細胞。使用胰蛋白酶/ EDTA 或TrypLE ExpresS目錄號12563）對細胞進行胰蛋白酶消化。取 一等份的胰蛋白酶化細胞懸浮液弁計數(shù)細胞以確定細胞密度。將細胞轉(zhuǎn)移到1.5mL微量離心管或15mL錐形管中，弁在室溫下以 100-400 X g離心細胞5分鐘。通過在室溫下以1

6、00-400 X g離心5 分鐘，用PBS （不含Ca2 +和Mg2 +）清洗細胞。吸出PBS弁以.0 X 10 7個細胞/ mL的最終密度將細胞沉淀重懸于ResuspensionBuffer R中。輕輕移液細胞以獲得單細胞懸浮液。避免在室溫下儲存細胞懸浮液超過15-30分鐘，從而降低細胞存活力和轉(zhuǎn)染效 率?？梢哉{(diào)整重懸細胞密度以適應電穿孔方案（第 18頁）或優(yōu) 化方案（第24-29頁）的推薦細胞數(shù)。.通過用含有血清和補充劑的 0.5mL培養(yǎng)基將孔插入24孔板， 不用抗生素，弁在潮濕的37 C/ 5 % CO 2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)板。如果您使用其他培養(yǎng)板，請參見第 18頁電鍍介質(zhì)卷建議。.對于每個

7、電穿孔樣品，下面列出了每孔的質(zhì)粒DNA或siRNA的推薦量，細胞數(shù)量和電鍍培養(yǎng)基的體積。使用再懸浮緩沖液T作為初級懸浮液FormatCell TypeDNA tpglsiRNA (nH)Necn* TipVoL plating mediumJU no.Buffer R or Buffer I*96-wellAdherentDl25-0.510-20010|jL100 |1L11-2 n 1(T10 pL/wetLSuspension0 5-1IOjjLD2-5 x 10*10 il_/weLLAdherent0.25-110-200IOjL250 |1L2.5-5 k 10*10 pL/weL

8、LSuspension0 5-2IOjjLC5-12.5* 10*tO |jl_/weU24-vyeLLAdherent0.5-210-200IQpLQ500 pL0.5-1 x 10s10 pL/welLSuspension0.5-310|jL1-2.5x 1Dft10 pL/weLl12-wellAdherent0.5-310-20DIOjjL1 rr_T x ,0-10 iL/wUSuspension0.5-310pL2-5 k 10slOpl/weLLAdherent0 5-310 pL) 5-30 (100 pL10 pL/100 pL2-4 k W10 pL nr100 |jL/w

9、eliL6-we LI10-200Suspension0.5-3 (10 pL) 5-30(100 pL10|jL/100pL2 mL0.4-1x10*10 pL or100 pL/welll60 mmAdherent5-3010-2D0四。pl0 5-1 10*IQDL/weLLSuspension5-30fflO pL5 mL1-2,50 ICT100 (jUweU10 cmAdherentS-3010-200USD pL10 mL1-2x10*100 L/wellSuspension5-30m)0 pL2-5 * IO4IDOpL/weU.使用3 mL電解緩沖液（使用緩沖液E, 10 L

10、Neon?Tip和緩沖 液 E2, 100 LNeon?Tip）裝入 Neon?移液管.根據(jù)您的單元格類型在設備上設置所需的脈沖條件.將適量的質(zhì)粒 DNA / siRNA轉(zhuǎn)移到無菌的1.5mL微量離心管 中。.將細胞加入到含有質(zhì)粒 DNA / siRNA的管中，輕輕混合。請參見上表，了解細胞濃度，DNA和電鍍量。.要將Neon?Tip插入Neon?移液器，請將移液器上的按鈕按到 第二個停止位置以打開夾具.將Neon?移液器的頂部插入Neon?Tip,直到夾具完全拿起活 塞的安裝桿（見下圖）Top-headNeon?移液器和尖端緊DNA / siRNA混合物吸入 Neon?Tip封在移液管上，沒

11、有間隙。14.輕輕釋放按鈕，繼續(xù)向移液器施加向下的壓力，確保尖端密15.將Neon?移液器上的按鈕按到第一站，弁將Neon?Tip浸入細胞DNA / siRNA混合物中。 緩慢釋放移液器上的按鈕，將細胞在移液過程中避免氣泡因為氣泡在電穿孔期間導致電弧air bubbles管的槽中弁小心地將新鮮樣品再次吸入尖端，無任何氣泡。16.將帶有樣品的Neon?移液器垂直插入放置在 Neon?移液器站轉(zhuǎn)染降低或失敗。如果您注意到尖端中有氣泡，請丟棄樣品Neon?Tube,直至聽到咔嗒聲。確保移液器突起插入吸液.確保Neon?移液器的金屬頭與 Neon?移液器支架內(nèi)的球形活塞和Neon?Tube （見左圖所

12、示的正確位置）緊密連接。.在傳送電脈沖之前，Neon?設備會自動檢查 Neon?Tube和Neon?Pipette是否正確插入。.在電穿孔期間監(jiān)測 Neon?Tip,以查看是否有由于尖端存在氣 泡引起的電?。ɑ鸹ǎ?。電弧導致轉(zhuǎn)染效率低，細胞活力低。.交付電脈沖后，觸摸屏上將顯示“ Complete”以指示電穿孔 完成。.從Neon?移液器站慢慢移除Neon?移液器，弁立即從 Neon?Tip中將樣品從移液器上按下第一個停留點，放入含有預 熱培養(yǎng)基的準備培養(yǎng)基中。.我們強烈建議將電穿孔細胞加載到?jīng)]有抗生素的生長培養(yǎng)基 中，這可以大大降低轉(zhuǎn)染后細胞的活力。.要放棄Neon?Tip,請按第二個按鈕的

13、按鈕進入適當?shù)纳镂?險廢物容器。.對剩余的樣品重復步驟7-16o使用兩次后，請務必更換Neon?Tips,弁在10次使用后更換Neon?TubeSo 每個新的質(zhì)粒 DNA樣品使用新的Neon?Tip和Neon?Tube.輕輕搖動板，以確保細胞的均勻分布。在37c下在加濕的CO2培養(yǎng)箱中孵育該板。注忌.如果您沒有使用Neon?設備，將后面的電源開關轉(zhuǎn)到 OFF位置。.避免在Neon?移液器臺內(nèi)溢出任何液體，以防止移液器臺上的 球塞上產(chǎn)生銹跡。.如果您不小心將任何液體（如緩沖液，水，咖啡）濺入 Neon? 移液器站內(nèi)，請將主機從主設備上斷開，弁用干燥的實驗室紙擦拭。倒置弁允許車站在室溫下完全干燥

14、24小時。優(yōu)化流程Examples Include: CEM, HL皿 K-562, JurkaL LCL. R&mos, U-937Suspension1.確保您按照第16-17頁所述制備細胞，使用 DNA或siRNA,弁 制備含有0.5 mL含有血清和無抗生素的培養(yǎng)基的 24孔板，以轉(zhuǎn) 移電穿孔細胞。準備足夠的細胞和質(zhì)粒 DNA / siRNA進行至少 30次轉(zhuǎn)染。2.對于使用24孔格式的10 LNeon?Tip的每個電穿孔樣品，請 參見下表。 對于以24孔格式使用100iLNeon?Tip,請將下表 中列出的數(shù)值適當調(diào)整10倍。CtU typeCell no.DNAfiRMAResosi

15、penSiiGn Buffer RAdherent1 m lOVed0.5g DNA/*tll15 pg/pQ【電50 pmolL in 10)jLt*p100 nM per weLLlOpL/cU2S5 pL/pl總旭Suspension2 - 107weLl1 pg DNA/wpII 30 pg/phte1 00 pmol in 10 ,iL tip2Q。nM per wellWpLAvelL27。pL/pkte3,使用3 mL電解緩沖液（將緩沖液 E用于10 LNeon?Tip和緩沖液E2, 100 LNeon?Tip）置于含有細胞 DNA / siRNA混合物的Neon?移液站中，如第

16、15頁所述。.按優(yōu)化和加載優(yōu)化協(xié)議開始電穿孔使用下列參數(shù)。SrrpiaWdl maPulse voltagePulse widthPulse no.ResullATransfection efficiencyColl viability1AlUse pre-optimized parameter cr control wittiout electroporation2UOO2013A315002014AA16002015嶼1700301Ab11003017中12UUJQ18321300叩19331400301101000401113511U001123612000113C1110020214C21211020Z15C31300202UC4ucn20217C5B50302I