1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。plackett-burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值-谷胱甘肽高產(chǎn)菌株的選育及其培養(yǎng)條件的研究賈建萍（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院杭州310014）摘要：以編號(hào)為ZG346的釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線和60Co射線誘變處理，運(yùn)用推理育種技術(shù)，選育到一株抗氯化鋅和乙硫氨酸的突變株0.5Eth400-5。該菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵谷胱甘肽產(chǎn)量為166.0mg/l，較出發(fā)株提高350.0%，每克干細(xì)胞含谷胱甘肽19.8mg，較出發(fā)株提高318.6%。菌株經(jīng)10次傳代培養(yǎng)，谷胱甘肽產(chǎn)量下降10.7%，是一株性狀較穩(wěn)定可深

2、入開(kāi)發(fā)研究的優(yōu)良菌株。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法對(duì)菌體積累谷胱甘肽的培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究和優(yōu)化，得到了1組優(yōu)化的培養(yǎng)基。采用此優(yōu)化培養(yǎng)基，谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)235.7mg/l，比優(yōu)化前提高45.4%。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下進(jìn)行5L發(fā)酵罐試驗(yàn)，谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)638.9mg/l。關(guān)鍵詞：谷胱甘肽，釀酒酵母，菌種選育，優(yōu)化BREEDINGOFAGLUTATHIONEOVERPRODUCINGSTRAINANDITSCULTURECONDITIONSJiaJian-Ping(CollegeofBiologyandEnvironmentEngineering,Zhej

3、iangUniversityofTechnology,Hangzhou310014)Abstract:Azincchloride-andethionine-resistantmutant0.5Eth400-5wasobtainedfromitsparentstrainSaccharomycescerevisiaeZG346byUVand60Co-raytreatmentandrationalscreening.Theglutathioneproductivityofthemutantreached166.0mg/lbyflaskculture,whichwas350.0%higherthant

4、hatoftheparentstrain,andtheglutathionecontentinthedriedcellsreached19.8mg/g,whichwas318.6%higherthanthatoftheparentstrain.Adescendofonly10.7%intheglutathioneyieldofthemutantwasobservedaftertentimesofsubculture.Therefore,theobtainedmutantisarelativelystablestrainthatisworthytobestudiedfurther.Systema

5、ticstudieswerecarriedoutontheoptimizationofcompositionsofmediumforaccumulatingthelargestamountofglutathioneinthestrain.ThisoptimizingmediumwasformulatedvasPlackett-Burmandesignandresponsesurfaceanalysis(RSA).Theglutathioneyieldwas235.7mg/lundertheoptimumcondition,whichwas45.4%higherthanthatofnon-opt

6、imizedmedium.Theglutathioneyieldwas638.9mg/lundertheoptimumconditionby5Lfermenterculture.Keywords:Glutathione,Saccharomycescerevisiae,Strainbreeding,Optimization谷胱甘肽（Glutathione,簡(jiǎn)稱(chēng)GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的活性三肽。它廣泛存在于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中，是最主要的非蛋白巰基化合物，具有重要的生理功能。它可作為某些酶的輔酶，并對(duì)一些巰基酶有激活作用，是保護(hù)酶和其它蛋白質(zhì)巰基的一種抗氧化劑，并且在氨基

7、酸轉(zhuǎn)運(yùn)、維持紅細(xì)胞膜的完整性、保護(hù)血紅蛋白及解除毒物等方面具有重要的作用1。在臨床上，谷胱甘肽是一種治療肝臟疾病、腫瘤、中毒、白內(nèi)障、衰老及變態(tài)反應(yīng)的重要生化藥物。近年來(lái)，隨著谷胱甘肽更多的生理功能被發(fā)現(xiàn)，它在食品添加劑、臨床醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)上倍受關(guān)注，需求量不斷增加。自谷胱甘肽首先由Hopkin2從酵母中提取出來(lái)以后，人們對(duì)它進(jìn)行了廣泛深入的研究。目前獲得高純度谷胱甘肽比較成熟的方法主要有溶劑萃取法和化學(xué)合成法。但這兩種方法存在著工藝繁瑣、成本高、易造成污染等問(wèn)題。因此，具有反應(yīng)條件溫和、成本低、反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)的發(fā)酵法將是今后生產(chǎn)谷胱甘肽最有前景的方法，獲得性能優(yōu)良的高產(chǎn)菌株是發(fā)酵法生產(chǎn)

8、谷胱甘肽的關(guān)鍵。目前已報(bào)道3，4，5能較多地積累谷胱甘肽的菌株主要有酵母和大多數(shù)革蘭氏陰性菌，采用的菌種選育方法主要是傳統(tǒng)的化學(xué)誘變法（亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等）和物理誘變法（紫外線和X射線）相結(jié)合，得到的突變株以1，2，4三唑和疊氮化鈉抗性株、乙硫氨酸抗性株、甲硫氨酸敏感株、丙酮酸抗性株、二硫化四甲基秋藍(lán)姆抗性株為主。但是利用射線對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)生菌株進(jìn)行誘變，同時(shí)獲得氯化鋅抗性標(biāo)記的高產(chǎn)菌在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)對(duì)菌體積累谷胱甘肽的培養(yǎng)條件報(bào)道往往是采用單因素多水平的優(yōu)化，未考慮碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子等多因素之間的協(xié)同作用6。作者從實(shí)驗(yàn)室收集和保藏的200余株酵母中篩選到了一株具有一定

9、谷胱甘肽生產(chǎn)能力的釀酒酵母，通過(guò)進(jìn)一步紫外線和射線誘變，得到了抗氯化鋅和乙硫氨酸的谷胱甘肽高產(chǎn)菌，同時(shí)應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法對(duì)谷胱甘肽高產(chǎn)菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。本文報(bào)道該菌種的篩選與選育及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，擬為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1菌種來(lái)源釀酒酵母（S.cerevisiae），浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室收集和保藏。1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件1.2.1斜面培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）及培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：酵母膏3.0g，麥芽汁3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，瓊脂20.0g，定容至1L水中，pH自然，1.0105Pa滅菌20min。培養(yǎng)條件：28

10、，培養(yǎng)12d。1.2.2平板選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：（1）ZnCl2選擇培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基+1360.0mg/lZnCl2，pH自然，滅菌20min；（2）乙硫氨酸選擇培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基+600.0mg/l乙硫氨酸，pH自然，1.0105Pa滅菌20min。28，培養(yǎng)57d。1.2.3種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：酵母膏3.0g，麥芽汁3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，定容至1L水中，pH自然，250mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基，1.0105Pa滅菌20min。28，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)22h23h。1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：葡萄糖1.95%，糖蜜1.95%，蛋白胨3.0%，C

11、ysHCl9.810-2%，MgSO47H2O0.5%，甲硫氨酸4.810-2%，生物素24.0g，肌醇75.0mg，酵母膏0.5g，麥芽汁30mL，NH4H2PO45.510-1g，VB10.8mg，(NH4)2SO412.4g，K2HPO43.0g，F(xiàn)eSO43.010-3g，ZnSO43.010-3g，CuSO40.510-3g，定容至1L水中，pH5.0，250mL三角瓶裝30mL培養(yǎng)基，0.7105Pa滅菌30min。接種量為10%，28，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)3d。1.3誘變處理1.3.1紫外線處理：取培養(yǎng)12d的新鮮斜面，用無(wú)菌生理鹽水洗下菌體制成菌懸液，經(jīng)玻璃珠振蕩打

12、散和脫脂棉過(guò)濾后得單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整菌懸液菌數(shù)108個(gè)/mL左右，取3mL菌懸液至無(wú)菌的小平皿中，在15W紫外燈（距離30cm）照射下，磁力攪拌30S，菌懸液在無(wú)菌室紅燈下適當(dāng)稀釋后涂平板，平板倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)57d。1.3.260Co射線輻照處理：采用培養(yǎng)好的新鮮試管斜面直接進(jìn)行輻照。分別以0.5KGy、2.0KGy劑量對(duì)試管中菌體進(jìn)行60Co射線輻照，用無(wú)菌生理鹽水將經(jīng)輻照處理后的斜面制成菌懸液，并經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂平板，平板倒置于28恒溫箱中培養(yǎng)57d。1.4菌種誘變程序出發(fā)株紫外線輻照自然分離60Co射線輻照谷胱甘肽高產(chǎn)菌。1.5分析方法1.5.1胞內(nèi)谷胱甘肽含量測(cè)定：ALLOX

13、AN試劑衍生法，見(jiàn)文獻(xiàn)7。1.5.2生物量測(cè)定：取10mL發(fā)酵液，于4500r/min離心4min，收集菌體，經(jīng)蒸餾水洗滌菌體兩次，棄去上清液，濕菌體經(jīng)105烘干至恒重后稱(chēng)重。2結(jié)果2.1誘變出發(fā)株的確定經(jīng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室收集和保藏的200余株酵母進(jìn)行搖瓶初篩和復(fù)篩，其中ZG346號(hào)釀酒酵母谷胱甘肽產(chǎn)量和谷胱甘肽含量最高，其谷胱甘肽產(chǎn)量為36.9mg/l，谷胱甘肽含量為4.7mg/克干細(xì)胞，確定以ZG346菌株作為誘變育種的出發(fā)菌株。2.2篩選平板中ZnCl2濃度的選擇Zn2+是多種脫氫酶、脫羧酶和肽酶的輔因子8，是酵母生長(zhǎng)所需的微量元素。在低濃度時(shí)有促進(jìn)酵母生長(zhǎng)的作用9，但高濃度的Zn2+對(duì)酵母有

14、殺菌和抑菌作用。ZnCl2濃度與致死率的關(guān)系如圖1所示，由圖可見(jiàn)，培養(yǎng)基中ZnCl2的濃度與實(shí)驗(yàn)菌株的致死率之間存在著明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著ZnCl2濃度的提高，致死率逐漸提高。當(dāng)ZnCl2濃度為680mg/l時(shí)致死率為80%，ZnCl2濃度超過(guò)2040mg/l時(shí)致死率100%，本文選取致死率為93.5%的ZnCl2濃度1360mg/l作為選擇性平板所用劑量。圖1ZnCl2濃度與致死率的關(guān)系Fig.1TherelationshipbetweenconcentrationofZincchlorideandlethality2.3誘變處理2.3.1紫外線誘變處理對(duì)ZG346菌株采用紫外線誘變處理

15、，將誘變處理后的菌懸液涂布于完全培養(yǎng)基和ZnCl2選擇培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后從平板上挑選生長(zhǎng)快、菌落大的單菌落各20個(gè)接種斜面，將各突變株與出發(fā)株分別接種至種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定生物量和谷胱甘肽產(chǎn)量，突變株的平均產(chǎn)量、最高產(chǎn)量、正變率及致死率結(jié)果見(jiàn)表1，隨機(jī)挑選的部分突變株的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表2。表1紫外誘變及其ZnCl2處理對(duì)菌種GSH積累的影響Table1TheeffectofUVandzincchlorideonglutathioneaccumulationStrainsGSHcontent(mgGSH/gdriedcell)GSHyield(mg/l)PostiveMutant

16、rate（%）Lethality（%）AverageMaximumAverageMaximumNo.346UVresistantmutantUV-andZincchloride-mutant4.76.07.14.79.611.436.945.153.436.978.192.252.363.878.692.5表2部分突變株搖瓶發(fā)酵結(jié)果Table2TheflaskcultureresultofanystrainsStrainsBiomass（g/L）GSHyield（mg/l）GSHyieldIncreaserate（%）GSHcontent(mgGSH/gdriedcell)GSHcontent

17、Increaserate/(%)346UVZn10-3UVZn10-5UVZn10-11UVZn10-17UVZn10-22UVZn10-25UVZn10-297.88.111.97.49.38.26.07.436.992.236.061.944.844.056.367.9150.0-2.566.321.319.252.784.24.711.43.08.44.85.49.49.2141.1-36.077.31.922.498.994.5表1結(jié)果可見(jiàn)，抗紫外線和ZnCl2的雙抗突變株的谷胱甘肽平均含量、平均產(chǎn)量均高于出發(fā)株和抗紫外線單抗突變株，同時(shí)其正變率亦高于抗紫外線突變株，這表明應(yīng)用ZnCl

18、2作高產(chǎn)突變株的篩選劑篩選效果明顯好于傳統(tǒng)的隨機(jī)篩選。由表2可見(jiàn)：（1）抗紫外線和ZnCl2突變株UVZn10-3谷胱甘肽含量和產(chǎn)量最高，每克干細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量達(dá)11.4mg，較出發(fā)株提高141.1%，谷胱甘肽產(chǎn)量為92.2mg/l，較出發(fā)株提高150.0%；（2）谷胱甘肽是胞內(nèi)產(chǎn)物，一定的生物量是高產(chǎn)的前提。UVZn10-3菌株谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)92.2mg/l，其生物量只有8.2g/L，而UVZn10-5菌株生物量達(dá)11.9g/L，但谷胱甘肽產(chǎn)量只有36.0mg/l，可見(jiàn)生物量與產(chǎn)量并不完全成正比。因此在菌種篩選時(shí)應(yīng)選擇谷胱甘肽含量高的突變株，再通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化提高其生物量，從而達(dá)到提高產(chǎn)量

19、的目的。為避免表型延遲現(xiàn)象引起的菌種不純，進(jìn)一步將紫外線、ZnCl2雙抗突變株UVZn10-3進(jìn)行自然分離，獲得了谷胱甘肽產(chǎn)量比UVZn10-3菌株提高41.8%的純化菌株H8。2.3.260Co射線誘變處理以H8為出發(fā)菌株，經(jīng)劑量2.0KGy、0.5KGy的60Co射線輻照處理后，將誘變后菌懸液涂布于完全培養(yǎng)基、氯化鋅選擇培養(yǎng)基、乙硫氨酸選擇培養(yǎng)基上，挑選生長(zhǎng)快、菌落大的單菌落各20個(gè)接種斜面，經(jīng)搖瓶二級(jí)發(fā)酵后測(cè)定生物量和谷胱甘肽含量，結(jié)果如圖2所示。圖260Co射線劑量和篩選平板對(duì)菌體積累GSH的影響Fig.2Theeffectof60Co-raydosageandscreeningfla

20、tonglutathioneaccumulationAverageGSHyield，AverageGSHcontent，MaximumGSHyield，MaximumGSHcontentA0.5KGy60Co-rayirradiation,ethionineselectivemedium;B2.0KGy60Co-rayirradiation,ethionineselectivemedium;C0.5KGy60Co-rayirradiation,completemedium;D2.0KGy60Co-rayirradiation,completemedium;E0.5KGy60Co-rayirra

21、diation,Zincchlorideselectivemedium;F2.0KGy60Co-rayirradiation,Zincchlorideselectivemedium由圖2可見(jiàn)，在6組試驗(yàn)中，以0.5Kgy射線輻照后涂布于乙硫氨酸平板上篩選出來(lái)的菌株結(jié)果最好，不光正變幅度大，正變幅度率也高。這是由于乙硫氨酸是谷胱甘肽的代謝類(lèi)似物，抗乙硫氨酸突變株能有效解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)，因此，該篩選模式有利于選育正向突變株。經(jīng)0.5Kgy射線輻照后的突變株中，編號(hào)為0.5Eth400-5乙硫氨酸抗性突變株最優(yōu)，該菌株谷胱甘肽產(chǎn)量為166.0mg/l，較原始菌株ZG346提高350.0%，每克

22、干細(xì)胞內(nèi)含谷胱甘肽19.8mg，較原始菌株ZG346提高318.6%。2.3.3突變株穩(wěn)定性考察用群體連續(xù)傳代及低溫保藏定期傳代的方法考察了0.5Eth400-5突變株高產(chǎn)基因的穩(wěn)定性。如表3所示，菌株0.5Eth400-5斜面連續(xù)傳10代，谷胱甘肽產(chǎn)量下降10.7%，生物量下降2.4%。同時(shí)將該菌株低溫保藏于4冰箱中，每月傳1代，共傳4代，谷胱甘肽產(chǎn)量?jī)H下降6.0%，說(shuō)明該突變株具有良好的穩(wěn)定性，但是對(duì)該菌株進(jìn)行定期復(fù)壯也是很有必要的。表3突變株穩(wěn)定性考察結(jié)果Table3TheresultsofthestabilityofthemutantTimesofsubcultureBiomass(g

23、/L)BiomassDecreaserate(%)GSHyield(mg/L)GSHyieldDecreaserate(%)0123456789108.48.48.38.38.38.38.38.38.28.28.20.01.21.21.21.21.21.22.42.42.4166.0163.5161.3160.0156.0152.8151.4150.3149.0148.6148.21.52.83.66.08.08.89.510.210.510.7注：表中數(shù)據(jù)均取自三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值2.4培養(yǎng)條件的優(yōu)化2.4.1種齡對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響圖3為菌種種子培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。從圖3可以看出種子培養(yǎng)到22h2

24、3h時(shí)，菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期，所以合適的種齡為20h-22h。圖3菌株0.5Eth400-5在種子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.3Thegrowthcurveofstrain0.5Eth400-5intheseedmedium2.4.2碳源對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響改變發(fā)酵培養(yǎng)基中不同碳源，保持其他成分不變，在相同培養(yǎng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵，測(cè)定谷胱甘肽產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出有機(jī)復(fù)合碳源產(chǎn)谷胱甘肽的能力好于單一碳源，其中以1.5%糖蜜和1.5%葡萄糖復(fù)合的碳源最有利于菌體積累谷胱甘肽，此時(shí)谷胱甘肽產(chǎn)量為172.2mg/l，比單一葡萄糖高35.5%，比單一糖蜜高19.4%。表4碳源對(duì)菌體積累谷胱甘

25、肽的影響Table4EffectofcarbonsourcesonglutathioneaccumulationCarbonsourcesGSHyield(mg/l)CategoryConcentration(%)molassesmolasses+glucosesaccharoseglucoseglucose+saccharose3.01.5+1.53.03.01.8+1.2144.2172.2159.7127.1163.2注：表中數(shù)據(jù)均取自三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值2.4.3氮源對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響為了研究氮源對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響，分別選取了幾種常用的無(wú)機(jī)和有機(jī)氮源進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表5。由

26、表可見(jiàn)，有機(jī)氮源蛋白胨產(chǎn)谷胱甘肽的能力明顯好于無(wú)機(jī)氮源，以蛋白胨為氮源，谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)161.1mg/l，比(NH4)2SO4高10倍，比(NH4)2HPO4高2倍，比尿素高4.7倍。表5氮源對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響Table5effectofnitrogensourcesonglutathioneaccumulationNitrogensourcesGSHyield(mg/l)CategoryConcentration(%)Peptone(NH4)2SO4NH4Cl(NH4)2HPO4urea3.03.53.03.52.0161.114.60.053.728.2注：表中數(shù)據(jù)均取自三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)

27、的平均值2.4.4培養(yǎng)基的初始pH對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液調(diào)成不同pH，分別對(duì)培養(yǎng)基pH4.5到pH7.0每隔0.5個(gè)單位進(jìn)行初始pH對(duì)谷胱甘肽積累的影響試驗(yàn)。結(jié)果（圖4）表明，菌株積累谷胱甘肽的能力以酸性條件下為宜，在pH5.0條件下谷胱甘肽含量最高，含量達(dá)163.5mg/l。圖4培養(yǎng)基的初始pH對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響Fig.4EffectofinitialpHonglutathioneaccumulation圖5培養(yǎng)溫度對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響Fig.5Effectoftemperatureonglutathioneaccumul

28、ation2.4.5培養(yǎng)溫度對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.0，分別從24到32每隔2進(jìn)行了培養(yǎng)溫度對(duì)谷胱甘肽積累的影響試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在26-28之間，溫度波動(dòng)對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響小于5%，以28為該菌體積累谷胱甘肽的最適培養(yǎng)溫度，谷胱甘肽含量為163.35mg/l，當(dāng)溫度超過(guò)30時(shí)谷胱甘肽含量明顯下降，這可能與谷胱甘肽易在高溫下被氧化的性質(zhì)有關(guān).2.4.6接種量對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響將新鮮培養(yǎng)20h-22h的種子液分別以6%，10%，14%，18%接種量接種于初始pH值為5.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28培養(yǎng)72h后測(cè)定谷胱甘肽的含量，結(jié)果表明（如圖6所示），

29、以10%的接種量最佳。圖6接種量對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響Fig.6Effectofinoculumsizeonglutathioneaccumulation2.4.7溶氧對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響酵母產(chǎn)谷胱甘肽是一個(gè)需能耗氧過(guò)程，所以有必要考察通氣量對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響。在250mL三角瓶中分別裝入20mL、30mL、40mL、50mL、60mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，在其他條件一致的情況下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示，菌體積累谷胱甘肽適宜的裝量為250mL三角瓶中裝30mL發(fā)酵培養(yǎng)基。不同的搖床轉(zhuǎn)速(140r/min、170r/min、200r/min、230r/min、260r/min)對(duì)菌體積累

30、谷胱甘肽的影響如圖8所示，以200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，谷胱甘肽的含量最高(163.55mg/l)。當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)高，溶氧過(guò)剩的情況下谷胱甘肽易被氧化。圖7搖瓶裝量對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響圖8搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響Fig.7EffectofmediumvolumesonglutathioneFig.8Effectofrotatingspeedonglutathioneaccumulationaccumulation2.4.8用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選培養(yǎng)基內(nèi)各組分發(fā)酵培養(yǎng)基因涉及的因素多，對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響是復(fù)雜的，很難用一種常規(guī)的方法處理。Plackett-Bur

31、man設(shè)計(jì)10是一種以不完全平衡塊為原理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能夠從眾多變量中快速、有效的篩選出最為重要的一些因素，供進(jìn)一步深入研究，并且具有數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單、適用于多個(gè)因素等優(yōu)點(diǎn)，被通常用于項(xiàng)目早期階段的篩選實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中部分組分對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響情況進(jìn)行了研究。選用了實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了11個(gè)因素：X1、X2、X11，每個(gè)因素取兩水平，以發(fā)酵液內(nèi)谷胱甘肽的含量Y(mg/l)為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)各培養(yǎng)基組分安排見(jiàn)表6、表7所示。同時(shí)借助ORIGIN軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并且通過(guò)t-檢驗(yàn)從11個(gè)因素中選出了5個(gè)對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響最為明顯因素：

32、糖蜜葡萄糖（X1），蛋白胨（X2），L-半胱氨酸鹽酸鹽（X3），硫酸鎂（X5），甲硫氨酸（X7）。表6Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table6Plackett-BurmanexperimentdesignanditsresponseNo.X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11Y（mg/l）123456789101112+1+1-1+1+1+1-1-1-1+1-1-1-1+1+1-1+1+1+1-1-1-1+1-1+1-1+1+1-1+1+1+1-1-1-1-1-1+1-1+1+1-1+1+1+1-1-1-1-1-1+1-1+1+1-1+1+1+1-1-1-1-1-1

33、+1-1+1+1-1+1+1+1-1+1-1-1-1+1-1+1+1-1+1+1-1+1+1-1-1-1+1-1+1+1-1+1-1+1+1+1-1-1-1+1-1+1+1-1-1-1+1+1+1-1-1-1+1-1+1+1-1+1-1+1+1+1-1-1-1+1-1+1-1166.16140.89153.77150.54180.97171.15161.50157.95128.65161.73149.25126.88表7以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素、水平及影響效果Table7Thefactors,levelsandresultsofPlackett-Burmanexperim

34、entdesignMassconcentrationofdifferentlevel(mg/l)CodedLevelT-testProb|T|Ranking-1+1X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11molasses+glucosepeptoneCysHClbiotinMgSO46H2OinositemethionineyeastgumNH4H2PO4VB2(NH4)2SO420000.0015000.00300.000.012.0075.00100.00300.00550.000.806000.0030000.00030000.000788.0000.0245.000100.00

35、0300.000500.0001000.0001.60012400.0001.836821.191791.34200-0.143741.05707-0.064690.91876-0.36479-0.41232-0.362550.157380.09610.260860.209370.888560.315350.94970.379850.722860.68880.724480.8780813210411576892.4.9響應(yīng)面分析法（RSA）優(yōu)化培養(yǎng)基配比響應(yīng)面分析法（RSA）10，是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合的產(chǎn)物，它包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、因子效應(yīng)評(píng)估及尋求因子最佳操作條件，是用來(lái)對(duì)所感興趣的響應(yīng)

36、受多個(gè)變量影響的問(wèn)題進(jìn)行建模和分析，能以很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時(shí)間優(yōu)化，從而取得明確、有目的的結(jié)論。近年來(lái)響應(yīng)面分析方法已成功地用于其他產(chǎn)品發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、酶解反應(yīng)等。通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，確定了5個(gè)對(duì)菌體積累谷胱甘肽影響顯著的因素，以這5個(gè)因素為研究對(duì)象，進(jìn)一步考察了它們對(duì)菌體積累谷胱甘肽的影響，并對(duì)培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)5個(gè)因素：糖蜜葡萄糖（X1）、蛋白胨（X2）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（X3）、硫酸鎂（X4）、甲硫氨酸（X5）為自變量，發(fā)酵液內(nèi)谷胱甘肽積累的含量Y（mg/l）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法和ORIGIN軟件設(shè)計(jì)了試驗(yàn)（表8），并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析（表9）。表85因

37、素5水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table8Theexperimentdesignof5factorsand5levelsFactorsCodeLevelConcentrationinmedium(mg/l)molasses+glucosepeptoneCysHClMgSO46H2OMethionineX1X2X3X4X5-1.5，-1，0，1，1.5-1.5，-1，0，1，1.5-1.5，-1，0，1，1.5-1.5，-1，0，1，1.5-1.5，-1，0，1，1.515，20，30，40，4515，20，30，40，450.35，0.5，0.8，1.1，1.250.5，2，5，8，9.50.03，0.12

38、，0.3，0.48，0.57表9響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table9TheexperimentresultsofResponseSurfaceMethodNo.LevelsGSHyield(mg/L)X1X2X3X4X5ExperimentresultsComputingresultsRelativeerror(%)1234567891011121314151617181920212223242526272829303132-1-1-1-1-1-1-1-1111111110000001.5-1.500000000-1-1-1-11111-1-1-1-11111000000001.5-1.500000

39、0-1-1111-1-1111-1-111-1-100000000001.5-1.50000-111-1-1-111-111-1-11-110000000000001.5-1.5001-11-11-11-11-11-1-111-1000000000000001.5-1.5134.05129.06150.40146.53130.56131.80122.32138.79220.16171.77194.70153.14202.31205.31176.23162.38200.81202.31200.32197.57211.30196.07205.69123.44189.96162.50200.9415

40、5.39184.72178.48183.84163.88131.74121.78154.22144.26154.22121.78131.74144.26210.51190.59188.03168.10190.59210.51188.03168.10188.86188.86188.86188.86188.86188.86192.18115.22188.86188.86184.17150.44188.86188.86200.07177.661.745.982.481.5715.348.237.153.794.589.873.558.906.152.476.283.406.337.126.074.6

41、111.883.827.037.130.5813.969.113.292.195.508.117.76根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用逐步回歸的方法進(jìn)行二次回歸分析，剔除影響不顯著的因子，得到回歸方程式如式（1）所示，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表10-12。Y=-126.86646+11.52652X1+207.83777X3-0.15627X12-106.47635X32-1.38354X1X5（1）表10回歸分析結(jié)果Table10RegressionresultsParameterValueErrort-ValueProb|t|a0a1a11a3a33a15-126.8664611.52652-0.15627207.8

42、3777-106.476351.3835438.356132.349920.0387569.6168843.056630.53451-3.307594.90506-4.032752.98545-2.472942.588450.00276FModelErrorTotal5263122548.81524825.444327374.25954509.76304185.5940124.299080.0001由式（1）及表10可見(jiàn)，葡萄糖、糖蜜濃度（X1）及L-半胱氨酸鹽酸鹽濃度（X3）對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量（Y）有很大影響，而且它們的二次項(xiàng)系數(shù)a11、a33均為負(fù)值，因而谷胱甘肽產(chǎn)量存在著極大值；葡萄糖、糖蜜

43、濃度和甲硫氨酸濃度的交互項(xiàng)（X1X5）對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量（Y）也有影響，但并不十分顯著；葡萄糖、糖蜜濃度（X1）在所有影響因素中是最顯著的，在一定的范圍內(nèi)，葡萄糖、糖蜜濃度濃度越高，菌體量越大，谷胱甘肽的產(chǎn)量越大，但由于釀酒酵母是克拉布特里（Crabtree）效應(yīng)陽(yáng)性菌9，高濃度葡萄糖導(dǎo)致好氧條件下菌體通過(guò)發(fā)酵作用獲取能量，不利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，所以對(duì)于葡萄糖、糖蜜濃度（X1）控制存在著一個(gè)最佳點(diǎn)。2.4.10培養(yǎng)基組成最佳濃度的獲取為了更進(jìn)一步確證培養(yǎng)基成分的最佳點(diǎn)，對(duì)已回歸的非線性模型方程求一階偏導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，求導(dǎo)方程整理得：207.8377-212.9527

44、X3=011.52652-0.31254X1+1.38354X5=0在回歸方程中，由于甲硫氨酸濃度X5與應(yīng)變量Y成線性關(guān)系，不存在著極值點(diǎn)，根據(jù)表9響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，取X5=0.48；另外由于自變量X2、X4對(duì)響應(yīng)值的影響很小，利用ORIGIN軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析的過(guò)程中已剔除它們的影響，對(duì)X2，X4的取值也根據(jù)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，取X2=30，X4=5。同時(shí)求解以上二組方程，得到菌體積累谷胱甘肽的最佳條件為：X1=39.0X2=30.0X3=9.810-1X4=5.0X5=4.810-1即培養(yǎng)基最佳濃度為：葡萄糖1.95%，糖蜜1.95%，蛋白胨3.0%，CysHCl9.

45、810-2%，MgSO47H2O0.5%，甲硫氨酸4.810-2%。2.4.11方程的驗(yàn)證由于以上最佳組合未包括在RSA的32個(gè)實(shí)驗(yàn)中，為進(jìn)一步確認(rèn)計(jì)算結(jié)果，以該法選出的最適培養(yǎng)基濃度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)將未優(yōu)化之前的培養(yǎng)基成分作為對(duì)照，優(yōu)化前發(fā)酵液內(nèi)菌體積累谷胱甘肽的產(chǎn)量為162.1mg/l，優(yōu)化后發(fā)酵液內(nèi)菌體積累谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)235.7mg/l，比優(yōu)化前提高45.4%，證明用RSA法來(lái)尋求菌體積累谷胱甘肽的最佳培養(yǎng)基濃度是可行的。2.55L發(fā)酵罐試驗(yàn)用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)條件在Biostat。b進(jìn)行5L全自動(dòng)發(fā)酵罐上試驗(yàn)，通過(guò)分批補(bǔ)料的方式流加培養(yǎng)基，發(fā)酵36h，發(fā)酵液內(nèi)最終谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)63

46、8.9mg/l，發(fā)酵過(guò)程有關(guān)參數(shù)變化見(jiàn)圖9。圖9釀酒酵母0.5Eth400-5在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.9ProcesscurveofglutathionefermentationbyS.cerevisiae0.5Eth400-5in5-literscalebatchbioreactor圖9中描述了菌體濃度（Cx），谷胱甘肽產(chǎn)量（Cp），葡萄糖消耗（Cs）、溶氧和發(fā)酵過(guò)程pH隨發(fā)酵進(jìn)程時(shí)間（t）的變化情況。由于發(fā)酵罐具有自動(dòng)控制pH值的功能，通過(guò)自動(dòng)流加氨水，發(fā)酵液內(nèi)pH始終維持在5.0左右。由圖9可見(jiàn)：（1）菌體開(kāi)始時(shí)生長(zhǎng)速度較慢，12h后加快，16h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到36h菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。與之相對(duì)應(yīng)谷胱甘肽產(chǎn)量經(jīng)過(guò)12h的延滯期后與菌體濃度同步增加，到36h谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)最高，為638.9mg/l，36h以后谷胱甘肽產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)，表明菌體濃度與谷胱甘肽產(chǎn)量是部分相關(guān)的過(guò)程。（2）隨著生物量的增加，總糖（以葡萄糖計(jì)）濃度迅速減少，到12h總糖濃度為初糖濃度的10%，所以12h后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行補(bǔ)糖。（3）隨著菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期以及谷胱甘肽產(chǎn)量快速增長(zhǎng)，需要大量的ATP來(lái)維持菌體生長(zhǎng)和谷胱甘肽生產(chǎn)，發(fā)酵液中溶氧迅速下降，20h時(shí)溶氧為初始時(shí)的25%。因此，20h需加大攪拌，提高通風(fēng)量以提高溶氧。3討論3.1抗氯化鋅突變株的篩選在細(xì)