1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。REACH法規(guī)第四卷譯稿-10-B.7.重復(fù)劑量(28天)毒性(口飼)1.測(cè)定方法1.1引言見引言B部分1.2定義1.3測(cè)定方法原理測(cè)定物質(zhì)以漸變的劑量每天給測(cè)定動(dòng)物口飼，每組一個(gè)劑量標(biāo)準(zhǔn)共持續(xù)28天。在喂食的這段時(shí)期內(nèi)每天仔細(xì)觀察動(dòng)物有否中毒跡象。在測(cè)定階段中死去的動(dòng)物要進(jìn)行驗(yàn)尸，而測(cè)定結(jié)束后宰殺仍活著的動(dòng)物并進(jìn)行解剖。這種方法強(qiáng)調(diào)了作為一種獨(dú)特端點(diǎn)的神經(jīng)病學(xué)作用，而壓制了對(duì)動(dòng)物進(jìn)行仔細(xì)臨床觀察以此來獲取足夠多信息的需要。這種方法應(yīng)確定化學(xué)物質(zhì)的神經(jīng)毒素潛能，這能保證在這方面更深入的調(diào)查研究。另外，這

2、種方法可能給出有關(guān)免疫學(xué)作用和再生器官毒性跡象的暗示。1.4.測(cè)定方法描述1.4.1.準(zhǔn)備工作隨機(jī)分配年輕健康的動(dòng)物到對(duì)照組和測(cè)定組?；\子的放置可能造成的影響必須減至最小。要確認(rèn)每個(gè)動(dòng)物并在測(cè)定開始前將它們置于籠中至少五天，以使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。測(cè)定物質(zhì)或通過管飼法或經(jīng)由食物或飲水喂食?？陲曃故撤椒ㄈQ于研究目的和物質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)。如有必要，測(cè)定物質(zhì)要溶解在或懸浮于合適的溶劑。推薦一旦有可能，首先考慮使用水溶液或懸浮液，其次是油溶液或乳狀液（如谷油），最后才是其他溶劑溶液。對(duì)于除水以外的其他溶劑必須知其毒性，測(cè)定物質(zhì)在溶劑中的穩(wěn)定性也需探明。1.4.2.測(cè)定條件1.4.2.1.動(dòng)物樣品傾向

3、于使用嚙齒目的鼠，盡管其他嚙齒目動(dòng)物也可使用。實(shí)驗(yàn)室通常仍使用的品種是年輕健康的成年動(dòng)物。雌性動(dòng)物需是從未生育過的的或未懷孕的。在動(dòng)物斷奶后盡可能早地開始給其喂食藥劑并且無論如何要在動(dòng)物九周大以前開始。在研究剛開始時(shí)，要減少使用的動(dòng)物間體重的差異并且不超過每種性別平均體重的20%。一旦重復(fù)口飼劑量研究作為一個(gè)初試到一個(gè)長期研究來進(jìn)行，那么應(yīng)在這兩個(gè)研究中使用來源于同一種源的合適動(dòng)物。1.4.2.2.數(shù)量和性別在每個(gè)劑量水平使用至少10只動(dòng)物（5只雄的5只雌的）。如果考慮到中期的死亡，就必須在研究完成前在動(dòng)物數(shù)量上增加預(yù)計(jì)要死掉的個(gè)數(shù)。另外，一個(gè)附屬的10只動(dòng)物組（每種性別各5只）可每天喂以最高

4、劑量水平的測(cè)定物質(zhì)持續(xù)28天并在喂食結(jié)束后的14天中進(jìn)行對(duì)恢復(fù)性或毒效持續(xù)性或毒效滯后表現(xiàn)的觀察。1.4.2.3.劑量水平一般來說，至少使用三個(gè)測(cè)定組和一個(gè)對(duì)照組。除了不喂食測(cè)定物質(zhì)外，必須以對(duì)待測(cè)定組動(dòng)物相同的方式來對(duì)待對(duì)照組動(dòng)物。如使用某種溶劑來喂食測(cè)定物質(zhì)，則對(duì)照組動(dòng)物需接受使用的最高劑量的溶劑。如果從其它實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的評(píng)估得知1000mg/kgbw/d的劑量不足以產(chǎn)生任何作用的話，就可進(jìn)行一個(gè)極限測(cè)定。如果無法得到任何合適的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可進(jìn)行一個(gè)范圍結(jié)果研究以此來幫助選定將使用的劑量。劑量水平的選擇需考慮到任何存在的毒效以及可獲得的有關(guān)測(cè)定物質(zhì)或相關(guān)物質(zhì)的（毒藥的）運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最高的劑量水

5、平是根據(jù)能誘導(dǎo)毒性作用而不致死或重傷的目的來選擇的。此后劑量水平的依次遞減應(yīng)根據(jù)能驗(yàn)證任何有關(guān)劑量大小的反應(yīng)以及在最低劑量水平不應(yīng)有任何可見的不好現(xiàn)象（NOAEL）這一原則來選擇的。在設(shè)定遞減的劑量水平時(shí)，通常2-4個(gè)交叉區(qū)間是最理想的。而另外的第四個(gè)測(cè)定組最好在相間的劑量水平間使用很大區(qū)間（如大于10的因子）。對(duì)于通過飲食或飲水喂食的情況來說，保證含有的測(cè)定物質(zhì)不影響正常營養(yǎng)或水平衡這一點(diǎn)是很重要的。當(dāng)測(cè)定物質(zhì)通過食物喂食時(shí)，不管是基于動(dòng)物體重的恒定的食物濃度（ppm）還是恒定的藥劑量水平都可采用；必須詳細(xì)闡明在上述二個(gè)選擇中選擇使用的那種方案。對(duì)于經(jīng)由管飼法喂食的情況，必須每天以類似次數(shù)喂

6、給藥物并根據(jù)需要調(diào)整以此來保證一個(gè)恒定的基于動(dòng)物體重的藥物劑量水平。一旦重復(fù)的劑量研究被作為一個(gè)初試到一個(gè)長期研究來進(jìn)行，在兩次研究中應(yīng)使用類似食譜。1.4.2.4.極限測(cè)定如果有一個(gè)通過食物或飲水喂食的測(cè)定，也使用了這個(gè)研究描述的過程，其劑量水平是至少1000mg/kg體重/天或在飲食或飲水中占相等的百分比（根據(jù)體重確定），而不產(chǎn)生任何可觀察到的毒效并且如果來自結(jié)構(gòu)上相關(guān)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示無法得到毒效，那么使用三個(gè)劑量水平的全面研究可能不需要了。這個(gè)限制測(cè)定在除了從人類接觸顯示應(yīng)使用更高劑量水平的情況下應(yīng)用。1.4.2.5.觀察期觀察時(shí)期為28天。計(jì)劃要進(jìn)行追蹤觀察的附屬組中的動(dòng)物要持續(xù)至少

7、14天不喂食藥劑，以此檢查毒效的滯后反應(yīng)現(xiàn)象或毒效的持續(xù)性或恢復(fù)情況。1.4.3.測(cè)定步驟在28天的時(shí)間內(nèi)每周七天要天天喂食動(dòng)物以測(cè)定物質(zhì)。每周五天的喂藥法有待證明。當(dāng)測(cè)定物質(zhì)經(jīng)有管飼法喂食時(shí)要使用一根胃管或合適的插管把單一藥劑喂給動(dòng)物。一次喂給液體的最大量是由動(dòng)物樣品的大小決定的。喂食量不能超過1ml/100g體重，除非在水溶液情況下最多可超過2ml/100g體重。除了那些在更高濃度下會(huì)產(chǎn)生惡化作用的刺激性或腐蝕性物質(zhì)外，必須通過調(diào)整濃度來減少喂食量的不同，以保證在所有劑量水平上恒定的量。1.4.3.1.綜合觀察綜合的臨床觀察每天必須進(jìn)行至少一次，最好是每天相同時(shí)間、次數(shù)并考慮在喂藥后達(dá)到預(yù)

8、期作用的頂峰時(shí)段進(jìn)行。要記錄下動(dòng)物樣品的健康狀況。每天至少兩次觀察所有動(dòng)物以得到發(fā)病率和死亡率。一旦發(fā)現(xiàn)瀕死動(dòng)物以及處于嚴(yán)重危險(xiǎn)或病痛的動(dòng)物，要移出去人道的宰殺并驗(yàn)尸。在第一次接觸前對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行一次詳細(xì)的臨床觀察并且在之后一星期內(nèi)也至少進(jìn)行一次。這些觀察需在籠子外的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)場(chǎng)地進(jìn)行且最好每次都在同一時(shí)間。要仔細(xì)做記錄，最好使用由測(cè)定實(shí)驗(yàn)室清楚定義的記錄系統(tǒng)。努力確保減少測(cè)定環(huán)境的差異，并且最好由不知情人士來進(jìn)行觀察。跡象記錄包括了但不僅限于皮膚的，毛皮的，眼睛的，粘膜的，分泌物的以及排泄和自發(fā)活動(dòng)的變化（如眼淚分泌過度，瞳孔大小，異常的呼吸方式）。在步態(tài)，姿勢(shì)，反應(yīng)，以及抽筋或僵硬動(dòng)作（如過

9、度增長，重復(fù)循環(huán)）或怪異行為（如自殘，倒步走）的表現(xiàn)上的變化也要記錄下來。在接觸的第四周，要進(jìn)行對(duì)不同類型刺激（如聽覺的，視覺的，本體感受的刺激）的感覺反應(yīng)以及緊握力量和肌肉運(yùn)動(dòng)活性的評(píng)估。在文獻(xiàn)上給出了可執(zhí)行過程的更多細(xì)節(jié)（見引言B部分）。當(dāng)研究室作為由初試研究轉(zhuǎn)向?yàn)楹髞淼拇伍L期（90天）研究來進(jìn)行時(shí)，就可以忽略在第四個(gè)接觸周內(nèi)進(jìn)行的功能觀察。在那種情況下功能觀察需包含在接下來的研究中。另一方面，從重復(fù)劑量測(cè)定的功能觀察中得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以增加隨后次長期研究選擇藥劑量水平的能力。例外的，對(duì)于那些在其他方面顯現(xiàn)出毒性跡象已達(dá)到明顯妨礙功能測(cè)定施行這一程度的組，功能觀察也可忽略。1.4.3.2.

10、體重和食物/水的消耗所有的動(dòng)物每星期必須稱重一次。消耗的食物和水至少每周稱量一次。如果測(cè)定物質(zhì)經(jīng)由水喂食，每星期稱量飲水至少一次。1.4.3.3.血液研究接下來的血液測(cè)定需在測(cè)定的最后進(jìn)行：血球密度，血球蛋白濃度狀態(tài)，紅血球數(shù)量，全部的和不同的白血球數(shù)量，血小板數(shù)量以及凝血時(shí)間的測(cè)量。血樣應(yīng)從一個(gè)標(biāo)記的位置采集，且是剛好在宰殺動(dòng)物之前或作為宰殺動(dòng)物過程的一部分進(jìn)行，并在合適的條件下儲(chǔ)存血樣。1.4.3.4.臨床生物化學(xué)為了研究在組織中的尤其是在腎和肝的主要毒性作用而進(jìn)行的臨床生化探究需在這樣獲得的血樣上進(jìn)行：這些血樣是剛好在宰殺動(dòng)物之前或作為宰殺動(dòng)物過程的一部分采集的（除了那些瀕死的和/或并發(fā)

11、死亡的）。推薦在采血前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行整夜禁食對(duì)于許多在血清或血漿中的測(cè)量來說，最好是整夜禁食，這一點(diǎn)對(duì)于葡萄糖來說尤其顯著。主要原因是由于不進(jìn)食產(chǎn)生的更多的變化會(huì)掩蓋更多微妙細(xì)小的現(xiàn)象并造成解釋上的困難。另一方面，整夜禁食可能會(huì)妨礙動(dòng)物一般的新陳代謝以及影響每日在測(cè)定物質(zhì)中的接觸，尤其在喂食研究中。如果采用整夜禁食方案，臨床生化研究就應(yīng)在研究第四周的功能觀察后進(jìn)行。血漿或血清測(cè)定需包括鈉，鉀，葡萄糖，全部膽固醇，尿素，肌酸酐，全部蛋白質(zhì)，白蛋白，以及至少兩種與肝細(xì)胞作用有關(guān)的酶（如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，堿性磷酸酶，-谷氨酸酶和山梨糖醇脫氫酶）。額外的酶（肝的或其他器官的）以及膽汁酸的測(cè)量

12、在一定情況下能提供有用信息。接下來的尿檢可隨意在研究的最后一周內(nèi)進(jìn)行，使用定時(shí)收集的尿液；外觀，體積，特定重力，ph值，蛋白質(zhì)，葡萄糖以及血液/血細(xì)胞。另外，要考慮用以探究廣泛組織損傷的血清標(biāo)記的研究。如果測(cè)定物質(zhì)的已知性質(zhì)可能或猜想會(huì)影響到包括鈣，磷酸鹽，甘油三酸酯，特定激素，以及乙酰堿酯酶在內(nèi)的新陳代謝概況的話就要進(jìn)行另一些研究。對(duì)于處在特定種類或基礎(chǔ)上的物質(zhì)，上述這些都需要確認(rèn)?？偟膩碚f，有必要根據(jù)動(dòng)物種類和由給定物質(zhì)產(chǎn)生的被觀察的和/或期待的作用來制定一個(gè)彈性方案。如果前期的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不夠充足，要在開始之前就要考慮由血液學(xué)的臨床生化學(xué)的變異得出的結(jié)論。1.4.3.5.身體解剖研究中所

13、用的所有動(dòng)物都要接受一次完整仔細(xì)的包括了體表所有通氣口以及頭蓋骨的，胸部的和腹部的空腔及其內(nèi)容物的檢查的身體解剖。所有動(dòng)物樣品的肝臟，腎臟，腎上腺體，睪丸，附睪，胸腺，脾臟，腦部以及心臟需整理成任何相連的合適的組織。并且在切割下來后要盡可能早地稱量它們的濕重以防止變干。以下組織需保存在對(duì)于組織類型以及打算接下來進(jìn)行的歷史病理學(xué)檢查來說都是最合適的固定環(huán)境中：腦部（包括大腦，小腦以及連接部分區(qū)域）脊髓，胃，小腸和大腸（包括派爾集合淋巴結(jié)），肝，腎，腎上腺，脾臟，心臟，胸腺，甲狀腺，氣管，肺（用固定劑填充并浸沒保存），性腺，附屬性器官（如子宮，前列腺），泌尿膀胱，淋巴結(jié)（最好是一個(gè)覆蓋了服藥路經(jīng)的

14、淋巴結(jié)和另一個(gè)遠(yuǎn)離服藥路經(jīng)來覆蓋系統(tǒng)作用的淋巴結(jié)），末梢神經(jīng)（髖部的或脛骨的）最好臨近肌肉以及一段骨髓（或者二者選其一地，一段新鮮骨髓抽?。ＥR床的及其他結(jié)果可能暗示檢查額外組織的必要性。同樣，任何根據(jù)已知測(cè)定物質(zhì)性質(zhì)被認(rèn)為有可能成為目標(biāo)器官的器官也要保存。1.4.3.6.組織病理學(xué)檢查必須對(duì)所有對(duì)照組和高劑量組的動(dòng)物樣品的保存器官做全面的組織病理學(xué)檢查。如果在高劑量組中觀察到與喂藥有關(guān)的變化，這些檢查就要擴(kuò)展到所有其他劑量組的動(dòng)物。檢查所有組織損傷器官。當(dāng)使用一個(gè)附屬組時(shí)需像對(duì)待測(cè)定組那樣對(duì)其組織和器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。2.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需提供個(gè)體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。另外所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需總結(jié)成表格形式，內(nèi)容

15、包括每個(gè)測(cè)定組在測(cè)定開始時(shí)的動(dòng)物數(shù)量，測(cè)定期間自然死亡或因人為因素殺死的動(dòng)物數(shù)量和死亡時(shí)間，表現(xiàn)出中毒跡象的動(dòng)物數(shù)目，對(duì)觀察到的包括開始時(shí)間，持續(xù)時(shí)間以及中毒作用的嚴(yán)重程度的中毒跡象的描述，有器官損壞現(xiàn)象的動(dòng)物數(shù)量，損傷類型和顯示每種損傷類型現(xiàn)象的動(dòng)物所占百分?jǐn)?shù)。如有可能，數(shù)字結(jié)果應(yīng)按照一種合適的且被廣泛接受的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行評(píng)算。應(yīng)在測(cè)定設(shè)計(jì)階段選擇統(tǒng)計(jì)方法。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如果可能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告應(yīng)該包含下列信息：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：動(dòng)物的種/屬；動(dòng)物樣品的數(shù)量，年齡和性別；來源，飼養(yǎng)環(huán)境和食物等；在測(cè)定開始時(shí)以及此后的每周，直至測(cè)定結(jié)束時(shí)動(dòng)物個(gè)體的重量。測(cè)定條件：如果溶劑不是水，合理的選擇介質(zhì)。劑量水平選擇的理論依據(jù)。有關(guān)測(cè)定物質(zhì)的組成/食物配置品的細(xì)節(jié)，包括配置品達(dá)到的濃度，穩(wěn)定性和均勻性。對(duì)測(cè)定物質(zhì)管理的細(xì)節(jié)。如果可行，要求從食物/飲用水中測(cè)定物質(zhì)的濃度（pp