1、第三節(jié) 代謝網(wǎng)絡中碳架 物質(zhì)流的調(diào)動 2022/7/191張星元：發(fā)酵原理 處于一定環(huán)境條件下的微生物培養(yǎng)物中，參與代謝的物質(zhì)在代謝途徑（網(wǎng)絡）中按一定規(guī)律流動，形成微生物代謝的物質(zhì)流。2022/7/192張星元：發(fā)酵原理 代謝物質(zhì)的流動過程是一種類似“流體流動” 的過程，它具備流動的一切屬性，諸如 方向性、連續(xù)性、有序性、可調(diào)性等等， 并且可以接受疏導、阻塞、分流、匯流等 “ 治理 ”， 也可能發(fā)生“ 干枯 ”和“溢出 ( 泛濫 ) ”等現(xiàn)象。此外，還有流速和流量等問題。2022/7/193張星元：發(fā)酵原理 化能異養(yǎng)型微生物以有機化合物為碳源和能源。因此，在討論化能異養(yǎng)型微生物代謝流動時，首

2、先抓住碳元素代謝這個主要矛盾，研究微生物細胞的碳架物質(zhì)流。2022/7/194張星元：發(fā)酵原理4.3.1 碳架物質(zhì)在代謝途徑（代 謝網(wǎng)絡）中的流動4.3.2 微生物的代謝流及其治理2022/7/195張星元：發(fā)酵原理4.3.1 碳架物質(zhì)在代謝途徑（代謝網(wǎng)絡）中的流動 在典型的工業(yè)發(fā)酵過程中，微生物的代謝流包括營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞、代謝中間物（碳架物質(zhì)）在代謝途徑中的流動和代謝產(chǎn)物從細胞進入環(huán)境這樣順序發(fā)生的過程。2022/7/196張星元：發(fā)酵原理4.3.1.1 有機化合物的組成元素及它們 各自在生命活動中的作用（略）2022/7/197張星元：發(fā)酵原理4.3.1.2 碳架物質(zhì)在代謝途徑中的流動

3、以代謝流動的觀點加深對代謝網(wǎng)絡的認識：碳架物質(zhì)在網(wǎng)絡的有關途徑中流動，從原料到終端產(chǎn)物碳架物質(zhì)流經(jīng)的路徑叫做載流路徑。2022/7/198張星元：發(fā)酵原理4.3.1.3 典型工業(yè)發(fā)酵的工作模式 典型的工業(yè)發(fā)酵要從發(fā)酵液中獲得微生物的代謝產(chǎn)物，也就是要讓原料有機化合物在微生物細胞的有關的代謝途徑（載流路徑）中流動的過程中，轉(zhuǎn)化成工業(yè)發(fā)酵的目的產(chǎn)物，最后目的產(chǎn)物分泌出細胞。2022/7/199張星元：發(fā)酵原理Working pattern of cell-machine in Industrial Fermentation工業(yè)發(fā)酵細胞機器的工作模式2022/7/1910張星元：發(fā)酵原理 上圖中，白

4、色橢圓代表細胞的界面，界面包圍部分是細胞機器，界面外側(cè)是細胞機器所在的環(huán)境。帶箭頭的黑線代表典型的工業(yè)發(fā)酵的細胞機器的載流路徑。 N代表營養(yǎng)物質(zhì)， P代表目的產(chǎn)物。2022/7/1911張星元：發(fā)酵原理4.3.2 微生物的代謝流及其治理2022/7/1912張星元：發(fā)酵原理 我們曾從熱力學的角度把微生物看作遠離平衡狀態(tài)的不平衡的開放體系；我們曾借助電學的知識來討論生物氧化和代謝能的問題；我們曾借用互聯(lián)網(wǎng)的概念來討論代謝網(wǎng)絡的延伸問題；在這里我們要借用流體力學的常識來分析微生物細胞的代謝流。 2022/7/1913張星元：發(fā)酵原理 如果把碳架物質(zhì)流看作水一樣的流體，那么按照工業(yè)發(fā)酵的工作模式，就

5、可把微生物活細胞看作是有一個總的進水口和一個總的出水口的、包含特定的管道網(wǎng)的大容器，組成管道網(wǎng)的管道有粗有細，管道網(wǎng)的管道有分支、有交叉，有可控的閥門。代謝物質(zhì)流就如同自來水一樣在管道和閥門的控制下流進和流出細胞，形成代謝流。2022/7/1914張星元：發(fā)酵原理 在這個認識的基礎上，結(jié)合代謝能支撐假說和代謝網(wǎng)絡假說的內(nèi)容，討論微生物的代謝及代謝流的變動性；結(jié)合本章（ 代謝調(diào)節(jié)的 3 個子系統(tǒng) ）的內(nèi)容，討論代謝流對環(huán)境條件的響應和代謝流治理的可能性。最后還要討論有關代謝節(jié)點的剛性的問題。2022/7/1915張星元：發(fā)酵原理 微生物的代謝途經(jīng)的變動性和可調(diào)節(jié)性，不但是代謝流飄移的內(nèi)在原因，而

6、且也是人工控制代謝流的生物學根據(jù)。工業(yè)發(fā)酵中，人的主觀能動作用表現(xiàn)在對代謝流的治理上。治理的直接的目的是讓微生物細胞過量合成（ overproduction ）人們所需要的代謝產(chǎn)物。2022/7/1916張星元：發(fā)酵原理4.3.2.1 碳架物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡中流經(jīng)的 分支處及各分支的流量分配 4.3.2.2 過量合成與微生物的異常代謝4.3.2.3 溢出代謝4.3.2.4 代謝流治理的可能性和現(xiàn)實性4.3.2.5 代謝網(wǎng)絡的剛性2022/7/1917張星元：發(fā)酵原理4.3.2.1 碳架物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡中流經(jīng)的分支處及各分支的流量分配 我們把代謝網(wǎng)絡中代謝途徑的交叉點叫做代謝網(wǎng)絡的 “ 節(jié)點 ”， 實

7、際上它們是碳架物質(zhì)在代謝網(wǎng)絡中流經(jīng)的代謝中間物。初級代謝網(wǎng)絡的中心板塊上的 12 種前體代謝物是當然的節(jié)點，而且還是代謝途徑的分流或匯流處。 2022/7/1918張星元：發(fā)酵原理 節(jié)點處不論發(fā)生匯流還是分流，都存在流量分配的問題。這個分配既與遺傳因素有關，又與條件因素有關。不同微生物物種的代謝途徑基本一致，因此，可在微生物學有關工具書查到有關的途徑；而代謝調(diào)節(jié)機制并不完全一樣，不一致的情況可在有關論文或綜述中找到。 2022/7/1919張星元：發(fā)酵原理 在生物化學中，早有一套描述代謝途徑的調(diào)節(jié)機制的方法，例如，用一個從效應物（途徑的終端產(chǎn)物）引出的、指向途徑中某個代表酶的短箭頭的長箭頭來標

8、示反饋調(diào)節(jié)。這種標示方法對于線狀途徑或偶有分支的途徑來說，是很有用的，但是，如果在代謝網(wǎng)絡圖中使用，代表調(diào)節(jié)的箭頭與代表酶的箭頭交織在一起，容易引起誤解。 因此我們要啟用一種新的代謝調(diào)節(jié)圖圖例，用來標記代謝網(wǎng)絡圖。這種標記方法有四個要點： 2022/7/1920張星元：發(fā)酵原理 標明調(diào)節(jié)方式 用“I”表示抑制（inhibition），用“A”表示激活（ activation ），用 “R” 表示阻遏（repression）；標明效應物 一般用三個字母標示效應物（ 調(diào)節(jié)特定的酶的水平或活性的化合物 叫做這種酶的效應物） ；2022/7/1921張星元：發(fā)酵原理標明受調(diào)節(jié)的酶： 代謝網(wǎng)絡圖中箭頭所

9、代表的酶的名稱放在括號內(nèi)， 標在該箭頭旁邊；對酶的調(diào)節(jié)的具體的表示方法： 在代表酶的箭頭旁邊標上代表效應物的 3 個字母和代表調(diào)節(jié)機制的特定字母。2022/7/1922張星元：發(fā)酵原理 例如：某效應物名稱后面加上 “I”， 標在代表酶的箭頭旁邊，表示該效應物對該酶的抑制作用；效應物名稱后面加上 “A”，標在代表酶的箭頭旁邊，表示該效應物對該酶的激活作用；效應物名稱后面加上 “R”，標在代表酶的箭頭旁邊，表示該效應物對該酶的阻遏作用。如果 2 種效應物協(xié)同作用，則在兩個效應物的名稱都寫上，再在后面加上對應的英文字母。 2022/7/1923張星元：發(fā)酵原理2022/7/1924張星元：發(fā)酵原理

10、上圖（碳架物質(zhì)在 EMP和 HMP途徑上的分流控制圖）是一張按此方法標示的網(wǎng)絡圖，請按此方法讀圖，并從以下說明中得到幫助。 大腸桿菌細胞磷酸果糖激酶（PFK）的酶水平隨條件而變動，有氧生長中細胞的PFK水平低于厭氧生長中的細胞，有氧生長中的細胞的PFK（由二聚體組成），對ATP不敏感，厭氧生長中的細胞的PFK （由四聚體組成），對ATP敏感。2022/7/1925張星元：發(fā)酵原理 在有氧條件下，由于PFK的低水平和 FDP 醛縮酶（FDPA）的極端低水平，大腸桿菌主要經(jīng) HMP 途徑降解葡萄糖。因為在有氧條件下 PFK 對 ATP不敏感，且其活力高于FDP醛縮酶（FDPA ），F(xiàn)DP 有累積，

11、所以它可能對 HMP 途徑的 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（ 6PGDH ）起抑制物的作用，使6PGDH成為HMP降解流上的一個“閥門”（有氧條件下的控制“閥門”）。2022/7/1926張星元：發(fā)酵原理 在厭氧條件下，PFK和FDPA水平較有氧時高，因而 EMP 途徑對葡萄糖降解代謝的參與程度增加。 因為 PFK 的水平仍高于FDPA，F(xiàn)DP 仍然累積并繼續(xù)抑制 6PGDH，但隨著EMP參與程度的增加，EMP 途徑所產(chǎn)生的NADH濃度增高。NADH是6-磷酸葡萄糖脫氫酶（ G6PDH ）的效應物，NADH 濃度上升就會抑制 G6PDH，使 G6PDH 成為 HMP降解流上的另一個 “ 閥門 ” （

12、 厭氧條件下的控制 “ 閥門 ” ）。 2022/7/1927張星元：發(fā)酵原理 這種抑制作用是必要的，因為提高葡萄糖濃度可以使 FDPA水平上升許多倍，而 PFK 水平基本保持不變，這樣 FDP 濃度勢必是低的，以致無法控制 6PGDH ，這時 NADH就通過對 G6PDH 的抑制作用控制 HMP 降解流。這種兩個“閥門 ”交替控制的機制可以解釋為什么在嚴格厭氧條件下，大腸桿菌經(jīng) HMP 途徑降解的葡萄糖只占葡萄糖降解總量的2030。2022/7/1928張星元：發(fā)酵原理4.3.2.2 過量合成和微生物的異常代謝 野生菌株在它們天然棲息地在其生長或維持，需要時也能合成人們所希望的代謝產(chǎn)物，但在

13、其固有的代謝調(diào)節(jié)機制的控制下合成的量不多不少，只夠細胞自身生長或維持的需要。體現(xiàn)了微生物細胞的經(jīng)濟性。2022/7/1929張星元：發(fā)酵原理 適用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物必須具有有過量合成的能力，也就是說是其目的產(chǎn)物的合成量必須大大高于它通常的合成量。要做到這一點，不僅要求合成目的產(chǎn)物的途徑暢通，還必須有將目的產(chǎn)物排出細胞的滿意的機制。過量合成的速率取決于微生物的遺傳性能，以及在培養(yǎng)條件下細胞的生理狀態(tài)。2022/7/1930張星元：發(fā)酵原理 把自然界中自然競爭中幸存的微生物稱為野生型微生物，它們具有比較嚴密的代謝調(diào)節(jié)功能，至少在它們幸存的環(huán)境條件下不會過量合成初級代謝產(chǎn)物。在這樣的細胞經(jīng)濟體系中，

14、細胞的生產(chǎn)力體現(xiàn)在其自身的增殖。細胞固有的生產(chǎn)關系支持細胞自身的增殖（生產(chǎn)細胞），不支持（人的） 目的產(chǎn)物的過量生產(chǎn)（生產(chǎn)特定的初級代謝產(chǎn)物）。2022/7/1931張星元：發(fā)酵原理 要解放細胞對于目的產(chǎn)物（特定的初級代謝產(chǎn)物）的生產(chǎn)力，就有必要改變細胞原有的生產(chǎn)關系。對微生物進行遺傳改造，就是要修正原有的生產(chǎn)關系。2022/7/1932張星元：發(fā)酵原理 微生物過量合成目的產(chǎn)物（特定的代謝中間產(chǎn)物）的過程，實質(zhì)上是功能殘缺或遺傳失常的微生物細胞在人為的特定條件下進行異常代謝的過程。因此，研究微生物過量合成指定的初級代謝產(chǎn)物的機理，就是研究工業(yè)微生物的病理學。2022/7/1933張星元：發(fā)酵原

15、理 微生物排出某些能量代謝副產(chǎn)物的過程，實質(zhì)上是兼性厭氧微生物在環(huán)境條件逼迫下（如缺氧），變通地維持生計的過程。兼性厭氧微生物細胞在缺氧的條件下，以變通的方式實現(xiàn)還原力的平衡和輔酶的再生和回用，使細胞的能量代謝得以維持，與此同時形成并分泌出能量代謝副產(chǎn)物。例如釀酒酵母在發(fā)酵液中累積能量代謝副產(chǎn)物乙醇的過程，就是這樣的過程。2022/7/1934張星元：發(fā)酵原理4.3.2.3 溢出代謝 發(fā)生溢出代謝（overflow metabolism）的原因是，代謝途徑前段的運轉(zhuǎn)速率大于后段的運轉(zhuǎn)速率。采用改變環(huán)境條件或限制營養(yǎng)供應等方法，可促使微生物進行溢出代謝。 這里介紹兩個溢出代謝的實例：TCA環(huán)中間

16、產(chǎn)物檸檬酸的溢出代謝，導致能量代謝的副產(chǎn)物乙醇生成的溢出代謝。 2022/7/1935張星元：發(fā)酵原理 檸檬酸的溢出代謝： 多種微生物均能因受激而過量合成檸檬酸。研究檸檬酸溢出代謝的最好的例子無疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定環(huán)境條件下累積檸檬酸，是因為在這種環(huán)境條件下代謝途徑前段的運轉(zhuǎn)速率大于后段的運轉(zhuǎn)速率。檸檬酸的溢出代謝是黑曲霉特有的遺傳和生化機制與培養(yǎng)條件共同起作用的結(jié)果。引起溢出代謝的原因包括以下三個方面：2022/7/1936張星元：發(fā)酵原理GlcG-6-P(PFK)CTA ,NH4I+AFDPPYROAAAcCoACTACAAICA- KG(PC)(CS)(KD)黑曲霉中檸檬酸的

17、代謝溢出2022/7/1937張星元：發(fā)酵原理 高水平的檸檬酸合成能力。這個能力由 3 個因素構(gòu)成。第一是在有高濃度草酰乙酸（OAA ）的情況下對 AcCoA 具有高度親和力的組成型的檸檬酸合成酶 （ CS ） 的存在；第二是催化丙酮酸 （ PYR ）固定 CO2 生成草酰乙酸反應的高水平的組成型的丙酮酸羧化酶（ PC ） 的存在；第三是在缺少錳的條件下，蛋白質(zhì)分解或蛋白質(zhì)合成受阻造成的銨的高濃度能解除檸檬酸（CTA）對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，檸檬酸的分泌降低其胞內(nèi)濃度。2022/7/1938張星元：發(fā)酵原理 較低的降解檸檬酸的能力。這能力由兩個因素構(gòu)成。第一是低水平的-酮戊二酸脫

18、氫酶（ KD ）影響 TCA環(huán)運行的暢通程度， 使TCA環(huán)前半部的中間產(chǎn)物積壓； 第二，在錳缺乏的條件下，順烏頭酸酶（ AE ）和 異檸檬酸脫氫酶 （ID）的活性降低，從而使檸檬酸的累積比其它幾種酸（ 順烏頭酸、異檸檬酸和-酮戊二酸）更明顯。 2022/7/1939張星元：發(fā)酵原理 在檸檬酸過量合成階段，培養(yǎng)基的 pH 值顯然會影響細胞膜對目的產(chǎn)物檸檬酸和的跨膜輸送；檸檬酸的分泌也會影響培養(yǎng)基的 pH 值。錳與鐵的缺乏有利于檸檬酸的排出。2022/7/1940張星元：發(fā)酵原理 乙醇的溢出代謝： 葡萄糖為碳源，對釀酒酵母進行批式培養(yǎng)，出現(xiàn)二段生長（ two growth phase）現(xiàn)象：在第一

19、階段，葡萄糖濃度較大，萄萄糖的消耗伴隨著乙醇的產(chǎn)生；第二階段，葡萄糖濃度下降到某值以下，乙醇被氧化。2022/7/1941張星元：發(fā)酵原理 這樣的二段生長現(xiàn)象曾被認為是呼吸途徑的阻遏和解阻遏，而且認為是分解代謝物阻遏（此名稱已被營養(yǎng)阻遏代替，見本章4.1.2.1 ）。后來才認識到，釀酒酵母之所以在葡萄糖培養(yǎng)基中累積乙醇，是因為該微生物有限的呼吸能力，并把這種現(xiàn)象稱為瓶頸效應（ bottleneck effect）。2022/7/1942張星元：發(fā)酵原理 細胞并不會因為葡萄糖的高速消耗而附帶地形成足夠高的呼吸能力（指呼吸鏈使NADH再生的能力）與之配套；而且葡萄糖的異生成途徑（需NADH）因受到

20、高濃度的葡萄糖的調(diào)節(jié)而受阻，更加強了瓶頸效應。因此瓶頸是對生物氧化中呼吸鏈電子傳遞通道的相對狹窄而言的。2022/7/1943張星元：發(fā)酵原理 在供氧情況下，釀酒酵母細胞中葡萄糖主要經(jīng) EMP-TCA 途徑（ 少量經(jīng)HMP途徑 ）氧化降解。這些途徑運行中形成的NADH和FADH2分子上的電子需經(jīng)電子傳遞鏈（呼吸鏈）傳遞給分子氧。 當葡萄糖濃度較低時，葡萄糖氧化降解過程所需配套的電子傳遞能力處于電子傳遞鏈傳遞能力范圍以內(nèi)，這時氧的吸收速率與細胞的生長速率成線性關系。輔酶NADH 和輔基 FADH2 完全可以在電子傳遞鏈釋放電子而得到再生。2022/7/1944張星元：發(fā)酵原理 當葡萄糖的濃度超過

21、某值，葡萄糖氧化降解過程所需配套的電子傳遞能力超越微生物細胞電子傳遞鏈傳遞能力范圍，一部分NADH不能通過電子傳遞鏈而再生成 NAD+， 只好將電子交給內(nèi)源的有機化合物乙醛，將乙醛還原成乙醇，從而實現(xiàn)還原力的平衡。從而導致生成乙醇的溢出代謝。由此可見，乙醇的溢出代謝實際上是細胞內(nèi)生物氧化過程中形成的還原力相對于電子傳遞鏈的呼吸能力的溢出，推動了乙醛還原生成乙醇的發(fā)酵過程。2022/7/1945張星元：發(fā)酵原理 從以上實例可以看到，溢出代謝的發(fā)生，不但要求微生物本身具有相應的遺傳根據(jù)，還必須具備相應的環(huán)境條件。 對于工業(yè)發(fā)酵來說，就是特定的生產(chǎn)菌種和與其對應的生產(chǎn)工藝條件。2022/7/1946

22、張星元：發(fā)酵原理4.3.2.4 代謝流“治理”的可能性和 現(xiàn)實性 代謝流具有流體流動的基本屬性，因此具有“治理”的可能性；微生物代謝的變動性和微生物遺傳的保守性，加上人的主觀能動性，能使可能變?yōu)楝F(xiàn)實。 本課程主要討論初級代謝產(chǎn)物的過量合成，兼顧次級代謝產(chǎn)物的合成。2022/7/1947張星元：發(fā)酵原理 現(xiàn)代發(fā)酵工程依靠微生物活細胞來完成發(fā)酵工廠生產(chǎn)線上不可缺少的加工（或轉(zhuǎn)化）步驟，在這個意義上，微生物活細胞就是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)線上不可缺少的微生物生物機器（或稱細胞機器），是發(fā)酵工廠里關鍵的生產(chǎn)機器。2022/7/1948張星元：發(fā)酵原理 細胞機器與普通意義上的機器不同，它們必須由代謝能 （ met

23、abolic energy）直接驅(qū)動。在發(fā)酵工廠的生產(chǎn)線上，微生物必須完成微生物細胞機器的在線制造（細胞增殖）和生產(chǎn)運行（目的產(chǎn)物的合成和輸出）的雙重任務。2022/7/1949張星元：發(fā)酵原理 根據(jù)工業(yè)發(fā)酵的現(xiàn)狀，把依靠化能異養(yǎng)型微生物合成某最終被分泌到胞外的初級代謝產(chǎn)物的過程，作為工業(yè)發(fā)酵的典型過程來研究，并把代謝研究的重點放在碳的代謝上。從而建立了生物機器（又稱細胞機器）工作的基本模式。在此工作模式的基礎上，提出了工業(yè)發(fā)酵中微生物代謝的五段式和初級代謝產(chǎn)物的過量合成的五字策略。2022/7/1950張星元：發(fā)酵原理 在物競天擇的基礎上建立的細胞經(jīng)濟體系已經(jīng)經(jīng)受長期的實踐檢驗，并已成為微生

24、物細胞生命活動的保障體系。微生物通過生存競爭而獲得的一整套自我調(diào)節(jié)機制，原本服務于微生物的自然競爭和生命保障，因此它不會大量的合成維持自我生存之外的代謝產(chǎn)物。而人類因自我發(fā)展的需要，卻希望微生物能夠大量地合成能滿足人類需求為目的產(chǎn)物（微生物的代謝產(chǎn)物）。 2022/7/1951張星元：發(fā)酵原理 微生物代謝產(chǎn)物的生物合成是系統(tǒng)工程，要完成這一類系統(tǒng)工程，必須依靠微生物的高度有序的生命活動，決不是打亂它，而是在可能的范圍內(nèi)對它進行有效的引導。 工業(yè)發(fā)酵呼喚人與微生物的合作，而在合作中，人處于主導的地位，人應該發(fā)揮主觀能動作用。2022/7/1952張星元：發(fā)酵原理 初級代謝產(chǎn)物的合成 初級代謝產(chǎn)物

25、是指這樣一些低分子質(zhì)量的合成途徑的終產(chǎn)物，它們是構(gòu)建生物大分子的分子模塊，是微生物營養(yǎng)性生長所必需的生長因子，如氨基酸、嘌呤和嘧啶的核苷與核苷酸以及維生素。2022/7/1953張星元：發(fā)酵原理 初級代謝產(chǎn)物都是從中心代謝途徑的中間產(chǎn)物（12種前體代謝物）開始合成的。因為它們都是微生物營養(yǎng)性生長所必需的，除了遺傳上有缺陷的菌株外，微生物細胞具有齊全的初級代謝途徑基因，也就是說在合適的環(huán)境條件下它們的初級代謝途徑是普遍存在的。初級途徑上的酶的特異性比次級代謝的酶的特異性要高。 2022/7/1954張星元：發(fā)酵原理 各種微生物的初級代謝產(chǎn)物的合成途徑基本相同，在同一屬微生物中，初級代謝產(chǎn)物合成途

26、徑的差異是十分罕見的，但在合成的調(diào)節(jié)機制上有較大的差異。 初級代謝產(chǎn)物合成的途徑是穩(wěn)定的，不同微生物物種的調(diào)節(jié)機制是可以弄清楚或基本弄清楚的，這就是對這種合成代謝流“治理”的基礎。這種“治理”要用到遺傳手段（遺傳脫鉤），并輔之以培養(yǎng)條件的優(yōu)化（環(huán)境協(xié)調(diào)），以求達到初級代謝產(chǎn)物過量合成的目的。2022/7/1955張星元：發(fā)酵原理. 初級代謝產(chǎn)物過量合成的五字策略 在分析細胞機器的生產(chǎn)運行時，可把它看作是分步進行的過程。首先細胞外的營養(yǎng)物質(zhì)從環(huán)境（培養(yǎng)基）跨膜進入細胞；然后，一般要經(jīng)過向心、中心和離心 3 段連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物；最后，目的產(chǎn)物經(jīng)過膜排出細胞，回到環(huán)境（發(fā)

27、酵醪液）。2022/7/1956張星元：發(fā)酵原理 “載流途徑”泛指承載代謝物流的代謝途徑?！拜d流路徑”泛指由不止一條載流途徑按序首尾銜接而組成的代謝通道。 在發(fā)酵工程領域，“載流路徑”作為發(fā)酵工程的專用術(shù)語，被定義為從主要有機原料到目的產(chǎn)物一組載流途徑的有序組合。2022/7/1957張星元：發(fā)酵原理 典型的載流路徑是指存在于代謝網(wǎng)絡中的這樣的代謝通道，即由多至五段承擔不同代謝分工的、依次銜接的代謝途徑組成的代謝通道。因此有載流路徑的五段式之稱。在這條載流路徑上流動的代謝主流對應地也有五段，從而派生出代謝主流的五段式。載流途徑的五段式和代謝主流的五段式統(tǒng)稱為微生物代謝的五段式。2022/7/1

28、958張星元：發(fā)酵原理 在此五段式的基礎上，從不同的角度出發(fā)，提出能作為一個整體，用于設計育種以及發(fā)酵工藝控制的五字策略（簡稱工業(yè)發(fā)酵的五字策略）：進、通、節(jié)、堵、出?！?五字策略 ” 就是從合作的良好愿望出發(fā)，發(fā)揮人的主觀能動作用，主動與微生物合作實現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵效益的策略。這個策略來自初級代謝產(chǎn)物過量合成的研究，故實際上是初級代謝產(chǎn)物過量合成的五字策略。2022/7/1959張星元：發(fā)酵原理NPP進出通節(jié)堵工業(yè)發(fā)酵的“五字策略”2022/7/1960張星元：發(fā)酵原理 高產(chǎn)菌種的代謝特征：不同來源的碳架物質(zhì)暢通地“注入”載流路徑，高速生成并順利釋出目的產(chǎn)物，如下圖。2022/7/1961張星元：

29、發(fā)酵原理進：在育種和發(fā)酵控制方面都要促進細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在發(fā)酵過程中，一般都希望菌體能迅速達到一定的濃度，因此，就必需選用生長旺盛的菌株，這類菌株吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力往往也較強。同時要選擇適當?shù)娜菀孜盏呐囵B(yǎng)基，和適宜的培養(yǎng)條件，以促進微生物的生長。為了消除底物在培養(yǎng)過程中的抑制作用，有的還采用流加的培養(yǎng)方法。為了促進微生物的生長和支持目的產(chǎn)物的合成，還要從代謝生理學的角度優(yōu)化流加條件。 2022/7/1962張星元：發(fā)酵原理通：在育種方面，解除對途徑中某些酶的反饋調(diào)節(jié)；在發(fā)酵控制方面，誘導這些酶的合成或激活這些酶，從而使來自各代謝物流（除碳架物流外還包括其他支持生物合成的物流）能夠暢通地

30、注入載流路徑，匯入代謝主流，流向目的產(chǎn)物。特別是當發(fā)酵進入目的產(chǎn)物合成階段后，必需確保載流路徑暢通，代謝主流優(yōu)勢明顯。 2022/7/1963張星元：發(fā)酵原理 這些酶包括用于目的產(chǎn)物自身合成的酶（如下圖中酶）和用于目的產(chǎn)物的前體合成的酶（ 如下圖中酶和，用于前體C的合成，酶，用于前體D的合成）。2022/7/1964張星元：發(fā)酵原理 例如在谷氨酸的發(fā)酵過程中，作為谷氨酸合成原料的 NH4+ 的缺乏， 就可能使谷氨酸合成途徑的中斷，導致谷氨酸產(chǎn)量下降，大量-酮戊二酸積累。當然，合成途徑中的任何一個限制因子，都可能產(chǎn)生類似的情況。因此，在發(fā)酵過程中應盡可能的使通向載流路徑的代謝途徑暢通無阻，使不同

31、的營養(yǎng)物質(zhì)能順利地注入代謝主流，最終流向目的產(chǎn)物。2022/7/1965張星元：發(fā)酵原理節(jié)：采用育種或發(fā)酵控制手段，節(jié)制載流路徑上與目的產(chǎn)物的形成無關或關系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物。這里所謂的 “ 節(jié)制 ” 是指封閉或削弱以目的產(chǎn)物合成途徑的起始底物（如下圖中的A）或各中間產(chǎn)物（如下圖中的B、C 和D）為起始底物的分支途徑（ 即下圖中通向 K，G，I，J 的途徑）。2022/7/1966張星元：發(fā)酵原理2022/7/1967張星元：發(fā)酵原理 經(jīng)過千千萬萬年的物競天擇，微生物細胞已經(jīng)成為自我保障的經(jīng)濟體系。細胞嚴格的調(diào)節(jié)機制不允許代謝中間產(chǎn)物的過量合成，要想實現(xiàn)目的產(chǎn)物的

32、過量合成，就必需對其代謝進行導向（包括遺傳根據(jù)和培養(yǎng)條件的導向），迫使代謝朝著過量合成目的產(chǎn)物方向進行。因此，不是目的產(chǎn)物生產(chǎn)所必需的途徑，應做到不同程度的關閉，也就是“節(jié)”。2022/7/1968張星元：發(fā)酵原理堵：采用育種或發(fā)酵控制手段堵塞或削弱目的產(chǎn)物進一步代謝的途徑（如上圖中 F 以后的途徑），包括目的產(chǎn)物參與的分解代謝和合成代謝。如果菌株生產(chǎn)目的產(chǎn)物的途徑暢通，但同時目的產(chǎn)物進一步代謝（包括目的產(chǎn)物參與的分解代謝和合成代謝）的途徑也暢通，或者隨著生產(chǎn)的進行目的產(chǎn)物進一步的代謝加強，都會最終影響目的產(chǎn)物的溢出代謝，降低工業(yè)發(fā)酵的效益。 2022/7/1969張星元：發(fā)酵原理 為了消除這

33、種影響，就必須降低目的產(chǎn)物進一步代謝的酶的酶活力或酶量，以消除或削弱目的產(chǎn)物進一步的代謝。若不能對菌株進行有效的改造，也可以通過工藝手段來達到堵的目的。例如，采用及時將目的產(chǎn)物從發(fā)酵液的分離出來的辦法，也可以間接地消除或削弱胞內(nèi)目的產(chǎn)物的進一步代謝，甚至能拉動溢出代謝。2022/7/1970張星元：發(fā)酵原理出：促進目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。根據(jù)微生物細胞經(jīng)濟學原理（節(jié)約原理、適應原理、生命保障原理），如果細胞內(nèi)某代謝中間產(chǎn)物濃度超過其閾值，必將受到細胞內(nèi)相關代謝調(diào)節(jié)機制的干預。胞內(nèi)目的產(chǎn)物的濃度過高，就會對合成目的產(chǎn)物的代謝過程施加負反饋調(diào)節(jié)，迫使其回到正常濃度。因此，及時將目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到細胞外

34、，無論從化學平衡的角度，還是從生物學信息反饋的角度，都將有利于載流路徑上代謝主流的流動。 2022/7/1971張星元：發(fā)酵原理 在育種和發(fā)酵控制方面加強“出”的辦法很多，如調(diào)節(jié)細胞對目的產(chǎn)物的通透性，增加輸送目的產(chǎn)物的載體蛋白的量，為目的產(chǎn)物的主動輸送提供代謝能等，都能使在胞內(nèi)生成的目的產(chǎn)物盡快的轉(zhuǎn)移出細胞，降低其細胞中的濃度；為了進一步降低細胞中目的產(chǎn)物的濃度，還可能根據(jù)目的產(chǎn)物的理化性質(zhì)，采用邊發(fā)酵邊分離目的產(chǎn)物的工藝，不斷的將目的產(chǎn)物從反應器中轉(zhuǎn)移出去，給代謝主流一個“拉動力”。2022/7/1972張星元：發(fā)酵原理.有關碳架物質(zhì)跨膜問題的分析 氨基酸的發(fā)酵法生產(chǎn)，屬于本課程定義的典型

35、的工業(yè)發(fā)酵。以糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的過程至少依次包括糖質(zhì)進入細胞、經(jīng)過代謝在胞內(nèi)生成目的氨基酸和目的氨基酸被分泌至培養(yǎng)基 3 個階段。此外，氨基酸的生產(chǎn)過程還包括細菌細胞的適度生長和生命活動的維持。2022/7/1973張星元：發(fā)酵原理 單考慮細胞內(nèi)的碳架物質(zhì)等的代謝是不夠的，至少還必須考慮營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞及目的產(chǎn)物排出細胞的問題，也就是碳架物質(zhì)通過細胞膜的問題。 有關碳架物質(zhì)跨膜問題，必要時可做專題講座。2022/7/1974張星元：發(fā)酵原理.有關代謝途徑的流量調(diào)節(jié)的分析 以天冬氨酸族氨基酸的合成代謝為例，來討論代謝途徑的流量調(diào)節(jié)。對細菌來說，天門冬氨酸族氨基酸包括Asp、Asn、Lys、

36、The、Ile 和 Met 共6 種氨基酸（ 或氨基酰胺），它們都是從 TCA 環(huán)中的前體代謝物草酰乙酸（OAA）開始合成的。2022/7/1975張星元：發(fā)酵原理 微生物細胞以葡萄糖為原料合成天冬氨酸族氨基酸時，碳架物質(zhì)通過代謝網(wǎng)絡的載流路徑流向目的產(chǎn)物，其載流路徑的上游部分從葡萄糖起到草酰乙酸止，草酰乙酸以后為下游部分。其上游部分屬于中心途徑，下游部分屬于離心途徑。因此天冬氨酸族氨基酸合成代謝流是跨代謝網(wǎng)絡的中心板塊和離心板塊的。關于天冬氨酸族氨基酸的合成代謝路線（下游部分）及其調(diào)節(jié)方式已匯總在下面幾張圖中：2022/7/1976張星元：發(fā)酵原理OAAAsp-Asp-PAsp- -SAHo

37、mo-SerThrDDPLysMetIle(AK1)Thr I Thr R I l e R(AK2)Met R(AK3)Lys I Lys RLys R(HD1)I l e R Thr R (HD2) Met R PYRPYRLys ILys RMet I, Met RMet RThr II l e RE.coli天門冬氨酸族氨基酸合成代謝的調(diào)節(jié)機制2022/7/1977張星元：發(fā)酵原理OAAAsp-Asp-PAsp- -SAHomo-SerThrDDPLysMetIle(AK)(HD) Met R Thr I PYRPYRMet RThr II l e RBrevibacterium fla

38、vium天門冬氨酸族氨基酸合成代謝的調(diào)節(jié)機制(Thr+Lys) I2022/7/1978張星元：發(fā)酵原理OAAAsp-Asp-PAsp- -SAHomo-SerThrDDPLysMetIle(AK)(HD) Met R Thr I PYRPYRMet RI l e IBrevibacterium lactofermentum天門冬氨酸族氨基酸合成代謝的調(diào)節(jié)機制Thr I, Lys,(Thr+Lys) I Leu R2022/7/1979張星元：發(fā)酵原理 芳香族氨基酸的合成也有類似的情況。其載流路徑的上游部分從葡萄糖起到磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖止，以后為下游部分。其上游部分屬于中心途徑，

39、下游部分屬于離心途徑。因此芳香族氨基酸合成代謝流是跨代謝網(wǎng)絡的中心板塊和離心板塊的。關于芳香族氨基酸的合成代謝路線（下游部分）及其調(diào)節(jié)方式已匯總在下面幾張圖中：2022/7/1980張星元：發(fā)酵原理PEP E-4-P(DS3)(DS2)(DS1)Phe ITyr IDHAPSMACMA(CM2)(CM1)Phe ITyr IPPAPEP Pi Phe TyrGlu- KGTrpGlu- KG3-P-GASerPRPPTrp IE.coli芳香族氨基酸的合成代謝調(diào)節(jié)機制2022/7/1981張星元：發(fā)酵原理PEP E-4-P(DS)Tyr,(Phe+Tyr) IDHAPSMACMA(CM)Phe

40、 IRTyr IPPAPEP Pi Phe TyrGlu- KGTrpGlu- KG3-P-GASerPRPPTrp IRCorynebacterium glutamicum芳香族氨基酸的合成代謝調(diào)節(jié)機制Trp ATyr A Trp I Phe ITyr I2022/7/1982張星元：發(fā)酵原理 下面是乳糖發(fā)酵短桿菌的賴氨酸高產(chǎn)菌株的設計育種示意圖。綠色箭頭連接成的路徑為用葡萄糖為主要碳源時的理想載流路徑。所謂 “ 理想載流路徑 ” 是指為了獲得高效益，人們期望代謝流流經(jīng)的路徑。2022/7/1983張星元：發(fā)酵原理GlcPYR-KGOAAAspAsp-SA- Asp-PDDPLysGluH-

41、SerMetThrIle（AK）( HD )(Thr+Lys) IThr I Met RDIAMINOPIMERIC ACID PATHWAY PEPG-6-PAsnHMPPYRPYRLeu RLeuBrevibacterium lactofermentum細胞外細胞內(nèi)2022/7/1984張星元：發(fā)酵原理 生物合成途徑同一性的一個例外：賴氨酸的生物合成途徑在細菌是二氨基庚二酸途徑，在真菌中是氨基己二酸途徑。上圖顯示的是乳糖發(fā)酵短桿菌的合成賴氨酸的二氨基庚二酸途徑，下圖顯示的是產(chǎn)黃青霉合成賴氨酸的氨基己二酸途徑。2022/7/1985張星元：發(fā)酵原理AMINO ADIPIC ACID PATH

42、WAYGlcPYR- KGH-ICA-AAAPenicillin G-AAA-SALysLys ILys RI-Penicillin N-AAA-L-Cys-D-Val-AAA-L-CysPenicillium chrysogenum2022/7/1986張星元：發(fā)酵原理.應用“五字策略”的實施 “節(jié)” 的成功實施：若以黃色短桿菌為出發(fā)菌株，選育 L-Lys 高產(chǎn)菌種，可采用高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株。假設高絲氨酸營養(yǎng)缺陷是因為高絲氨酸脫氫酶（ HD ）缺損而造成的，從前面對應的圖可找出造成 L-Lys高產(chǎn)的原因：阻止碳架物質(zhì) Asp-SA 流向H-Ser；解除 Thr、Lys對天門冬氨酸激酶（

43、 AK ）的協(xié)同反饋抑制（因為細胞不能合成Thr）；省下原用于11e合成的PYR，以支持Lys合成。2022/7/1987張星元：發(fā)酵原理 從結(jié)構(gòu)類似物的超敏性突變株中獲得高產(chǎn)菌株是可行的，但必須注意這里 “ 結(jié)構(gòu)類似物 ” 是指酶的底物的結(jié)構(gòu)類似物，前述的“酶” 必須是與微生物的生長密切有關的酶。與微生物生長有密切關系的酶的底物的結(jié)構(gòu)類似物，如果能競爭性地抑制這個酶的活性，就會直接影響微生物的生長，也就是這種微生物對這種結(jié)構(gòu)類似表現(xiàn)出敏感性。這種敏感性的大小與酶水平的高低相關，敏感性小的菌株酶水平高，敏感性大的菌株酶水平低，特別敏感的（超敏的）的菌株酶水平最低。2022/7/1988張星元：

44、發(fā)酵原理 根據(jù)這個道理，有可能從這種酶的底物的結(jié)構(gòu)類似物的超敏性突變株中，找到這種酶的低水平突變株。酶水平低，代謝流的通道就窄，就意味著“節(jié)”（節(jié)流）。 氟代丙酮酸（ FP ）是丙酮酸（ PYR ）的結(jié)構(gòu)類似物。PYR是與生長密切相關的丙酮酸脫氫酶（ PD ） 的底物，如果用葡萄糖為唯一碳源，PD 是唯一通向 AcCoA和TCA環(huán)的通道，若 PD 完全阻塞，微生物就無法通過TCA環(huán)和電子傳遞獲得代謝能，有關的合成代謝也無法進行。2022/7/1989張星元：發(fā)酵原理 已用超敏性突變株的方法選育了乳糖發(fā)酵短桿菌的氟代丙酮酸超敏性突變株（FPs）。根據(jù)對FP超敏程度的不同，選得不同程度的PD缺損株

45、（ PD的不同程度的低水平株 ），從中找到了 PD水平低到恰到好處的突變株，既不過分削弱 PD 以提供足夠的代謝能，又能使碳架物質(zhì)較多地流向 OAA 以合成更多的Lys。從而實施了對PD通道的 “節(jié)”。 2022/7/1990張星元：發(fā)酵原理 “通”的實施： 賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物S-（-aminoethyl）-L-Cys，簡稱 AEC，是最早用于氨基酸育種并取得明顯效果的結(jié)構(gòu)類似物。 在黃色短桿菌的亮氨酸缺陷型突變株 Leu-上再加上結(jié)構(gòu)類似物抗性標記（ AEC+Thr ）r 后Lys產(chǎn)量大幅度上升，這是因為這個突變株已解除了Lys和Thr對天門冬氨酸激酶（ AK ）的協(xié)同反饋抑制，是個調(diào)節(jié)突變株。 關于“進”、“出”、“堵”的策略應用也都有成功的實例。 2022/7/1991張星元：發(fā)酵原理 次級代謝產(chǎn)物的合成 人們一般把微生物營養(yǎng)性生長所需的代謝產(chǎn)物（直接或間接的參與細胞結(jié)構(gòu)或組成）叫做初級代謝產(chǎn)物，把微生物在限制生長或沒有生長的條件下形成的、對微生物