1、1.2基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序1目的基因的獲取。2_的構(gòu)建。3將目的基因?qū)隷。4目的基因的檢測(cè)與鑒定?；虮磉_(dá)載體受體細(xì)胞預(yù)習(xí)提綱:一、為什么要有“目的基因的獲取”這一步？二、為什么要有“表達(dá)載體的構(gòu)建”這一步？ 有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性 單獨(dú)的DNA片段目的基因是不能穩(wěn)定遺傳的。構(gòu)建表達(dá)載體的目的是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。三、為什么要有“目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”這一步？ 四、為什么要有“目的基因的檢測(cè)與鑒定”這一步？ 含有目的基因的表達(dá)載體只有進(jìn)入受體細(xì)胞，并且維持穩(wěn)定和

2、表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化 因?yàn)槟康幕蚴欠裾嬲迦胧荏w細(xì)胞的DNA中，是否能夠在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)，只有通過(guò)檢測(cè)、鑒定才能得知。2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法鳥(niǎo)槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶H2.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基

3、因)1. 概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng) 在生物_ 復(fù)制_ 的核酸合成技術(shù) 2.原理：_4.方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）5.結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外 特定DNA片段DNA復(fù)制指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3.過(guò)程:(變性、退火、延伸)條件：四種脫氧核苷酸一對(duì)引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板溫度控制PCR技術(shù)的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。點(diǎn)點(diǎn)生物學(xué)教學(xué)尋根問(wèn)底（1）為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？提示：構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，

4、并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。1. 作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？答：不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子

5、、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠

6、表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼蛋白質(zhì)調(diào)控調(diào)控原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞1.啟動(dòng)子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄.2.終止子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾部，起終止轉(zhuǎn)錄的作用.1.用一定的_切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出_。2.用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。 核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入適量_，形成了一個(gè)重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表

7、達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種 限制酶 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。特別提醒 用限制酶切割載體和含目的基因的DNA分子時(shí)，可以使用不同的限制性核酸內(nèi)切酶,但是必須切出相同黏性末端。不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，都由四種脫氧核糖核苷酸組成，都遵循相同的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則：AT，GC。下圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoR、BamH的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tctR為四環(huán)素抗性

8、基因，P為啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoR、BamH在內(nèi)的多種酶的酶且位點(diǎn)。“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。目的基因-載體連接物 載體-載體連接物 目的基因-目的基因連接物 分離純化 （1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoR酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有 、 、 三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn)行 ?！皾h水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公

9、益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。啟動(dòng)子mRNAEcoR和BamH （3）目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是 ，其合成的產(chǎn)物是 。（4）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是 。“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。16（2011上海57）回答下列有關(guān)基因工程的問(wèn)題。（1）基因工程中使用的限制酶，其特點(diǎn)是 下圖四種質(zhì)粒含

10、有E1和E2兩種限制酶的識(shí)別，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四環(huán)素的抗性基因。（2）將兩端用E1切開(kāi)的Tcr基因與用E1切開(kāi)的質(zhì)粒X1混合連接，連接后獲得的質(zhì)粒類(lèi)型有。（多選）AX1 BX2 CX3 DX4特異性的識(shí)別和切割DNAABC“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記?！皾h水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（3）若將上圖所示X1、X2、X3、

11、X4四種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，然后分別涂布在含有青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上。在這兩種培養(yǎng)上均不能生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞類(lèi)型有、。（4）如果X1用E1酶切，產(chǎn)生850對(duì)堿基和3550對(duì)堿基兩種片段：那么質(zhì)粒X2（Tcr基因的長(zhǎng)度為1200對(duì)堿基）用E2酶切后的片段長(zhǎng)度為對(duì)堿基。無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞含X-3的細(xì)胞4750“漢水丑生的生物同行”超級(jí)群大型公益活動(dòng)：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2012年1月15日，漢水丑生標(biāo)記。（5）若將外源的Tcr基因兩端用E2切開(kāi)，再與用E2切開(kāi)的X1混合連接，并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，結(jié)果顯示，含X4的細(xì)胞數(shù)與含X1的細(xì)胞數(shù)之比為13，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？。原因是不能