1、新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)【摘要】目的：討論新生大鼠心肌細(xì)胞的別離和培養(yǎng)方法。方法：應(yīng)用0.0625%的胰蛋白酶重復(fù)消化出生第2d乳鼠的心肌組織屢次,搜集的細(xì)胞用含10%胎牛血清的de培養(yǎng)基中和，用差速貼壁別離法別離，在以溴脫氧尿嘧啶brdu純化心肌細(xì)胞后置2培養(yǎng)箱孵育7d。結(jié)果：別離1只乳鼠獲得的心肌細(xì)胞產(chǎn)量約為140萬個(gè)，且有活力心肌細(xì)胞占90以上；培養(yǎng)46h的乳鼠心肌細(xì)胞開場貼壁生長,1224h明顯增殖,34d后細(xì)胞交融成片；心肌細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮?、星形、多角?并出現(xiàn)自發(fā)性節(jié)律性搏動(dòng)。結(jié)論：本研究應(yīng)用的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法可獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細(xì)胞，是一種可靠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法?！?/p>

2、關(guān)鍵詞】心??；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；大鼠priaryulturefnenaterattusardiyte/afang|fang，shenxia|li，linli|fang，hanli|li/hinesejurnalfardivasularrehabilitatinediine,2022，182:125authrsaddress：fujianprvinialhspital，fujianedialuniversity，fuzhu,fujian,350001，hinakeyrds：yardiu;ellulturetehniques;rat自1960年haray等1首次對乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)展培養(yǎng)以來，國內(nèi)、外許

3、多學(xué)者對心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法進(jìn)展了研究。體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞可以保持其在體內(nèi)原有的許多構(gòu)造和功能，同時(shí)排除了神經(jīng)、體液等因素的干擾，因此體外培養(yǎng)在心肌細(xì)胞的生長、發(fā)育、生理、代謝、病理等研究中具有重要意義。然而心肌細(xì)胞在別離過程中易受損傷,活細(xì)胞也很少分裂，且不易傳代,因此進(jìn)步心肌細(xì)胞產(chǎn)量和活力是許多學(xué)者研究的目的。本實(shí)驗(yàn)參照sipsnp等2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法并作了改良，討論了乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)的方法，對心肌細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)狀況進(jìn)展觀察，并對其純度進(jìn)展了鑒定，從而獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細(xì)胞。1資料與方法1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇出生第2d的sd乳鼠,雌雄不拘由福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主

4、要儀器與試劑:二氧化碳培養(yǎng)箱，lypus倒置顯微鏡,超凈工作臺(tái)，低速自動(dòng)平衡離心機(jī),恒溫磁力攪拌器;de培養(yǎng)基(hyln公司)、胎牛血清(hyln公司)、胰蛋白酶(gib公司)、d-hanks液(hyln公司)、溴脫氧尿核苷(brdu，siga公司)、小鼠抗大鼠sarerieatin單抗(博士德公司)；山羊抗小鼠igg(博士德公司)。1.2方法1.2.1心肌細(xì)胞的別離:取第2d的sd乳鼠，無菌條件下開胸取心尖部，用預(yù)冷的d-hanks液洗滌3遍，將心臟剪成約13大小；用0.0625的胰酶在37恒溫磁力攪拌器中消化心肌組織，消化過程中采用分次消化時(shí)間(5in5次,6in5次,7in5次,8in5

5、次)，第一次消化后自然沉淀并棄上清，以后自然沉淀后取上清；每次別離的上清液加等量含10胎牛血清的de培養(yǎng)液輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，1000r/in離心10in，重復(fù)3次。1.2.2心肌細(xì)胞的培養(yǎng):細(xì)胞懸液放2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90in后，采用差速貼壁別離技術(shù),吸收培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0105細(xì)胞/l，將單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中，前3d滴入brdu使其終濃度為0.1l/l，并繼續(xù)培養(yǎng)；24h后換液,以后隔日換液。1.2.3心肌細(xì)胞搏動(dòng)率的觀察:在倒置顯微鏡下觀察第1d至第7d心肌細(xì)胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化，并攝像記錄自發(fā)搏動(dòng)頻率。隨機(jī)計(jì)數(shù)培養(yǎng)至第4d的心肌細(xì)胞的搏動(dòng)率。細(xì)胞搏動(dòng)率()=搏動(dòng)

6、細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)100。1.2.4心肌細(xì)胞存活率的測定:取一樣量的0.4臺(tái)盼藍(lán)液與細(xì)胞懸液混勻后再取適量混合液滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，隨機(jī)取10個(gè)高倍20視野計(jì)數(shù)4個(gè)大格中的細(xì)胞總數(shù)及未染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)10次，取平均值。細(xì)胞存活率()=活細(xì)胞數(shù)細(xì)胞總數(shù)100.2結(jié)果2.1消化時(shí)間對心肌細(xì)胞活力和細(xì)胞產(chǎn)量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用0.0625%胰蛋白酶、37恒溫低速磁力攪拌及分次消化時(shí)間為8in時(shí)心肌細(xì)胞活力和細(xì)胞總數(shù)較理想，見圖1，圖2。并且隨著總消化時(shí)間的延長，細(xì)胞活力程下降趨勢,見圖3。2.2培養(yǎng)心肌細(xì)胞的形態(tài)特征培養(yǎng)46h后,在倒置顯微鏡下可觀察到心肌細(xì)胞開場貼壁生長,初為圓形,后為梭形,

7、偶見單個(gè)細(xì)胞開場搏動(dòng),繼而細(xì)胞逐漸在瓶壁外表鋪展；隨后細(xì)胞不斷分裂、增殖,數(shù)量逐漸增多,形成不規(guī)那么的星形,細(xì)胞鋪展?fàn)顩r更加明顯,并伸出偽足；在培養(yǎng)第34d,偽足可互相接觸交織成網(wǎng),形成細(xì)胞單層或細(xì)胞簇,呈放射狀排列的同心圓狀,其搏動(dòng)同步化,形成所謂功能性合體細(xì)胞，見圖4圖7見封三；至第4d自發(fā)搏動(dòng)達(dá)頂峰，搏動(dòng)率為8590；至第7d搏動(dòng)率開場減少。2.3心肌細(xì)胞純度的鑒定橫紋肌肌動(dòng)蛋白(a|atin)單克隆抗體作為一抗，用sab法進(jìn)展免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見胞漿呈棕黃色染色；非心肌細(xì)胞染色呈陰性。結(jié)果顯示幾乎所有的細(xì)胞呈現(xiàn)陽性,說明此時(shí)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞較純，見圖8見封三。3討論心肌細(xì)胞培養(yǎng)能提供單

8、個(gè)細(xì)胞的同源性集落，在可視、可控制的環(huán)境中對心肌細(xì)胞的特性、藥理、病理、生理、代謝和分子生物學(xué)等方面進(jìn)展根底研究，具有產(chǎn)量大，重復(fù)性好及不受神經(jīng)、體液因素影響的特點(diǎn)，已成為心血管研究的根本方法和手段之一，有著廣闊的應(yīng)用前景。由于各實(shí)驗(yàn)室所需要解決的問題、實(shí)驗(yàn)材料的取舍、實(shí)驗(yàn)室詳細(xì)條件不同等,所采用的細(xì)胞培養(yǎng)方法也不盡一樣。本研究采用0.0625%低濃度胰蛋白酶、37恒溫低速磁力攪拌及短時(shí)間屢次消化的方法別離新生大鼠心肌組織,以獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細(xì)胞?，F(xiàn)對新生大鼠心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響因素進(jìn)展總結(jié),以進(jìn)步心肌細(xì)胞培養(yǎng)的存活率。消化酶種類的選擇：別離心肌細(xì)胞通常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶3，也

9、有在胰蛋白酶或膠原酶中參加脫氧核糖核酸酶dnase4，目的是防止從損傷細(xì)胞中釋放的dna積聚。而本實(shí)驗(yàn)室通過單獨(dú)用胰蛋白酶消化得到較高質(zhì)量的細(xì)胞，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)本錢。消化酶濃度和消化時(shí)間的選擇：新生大鼠心肌細(xì)胞對酶消化極為敏感，因此消化酶的濃度和消化時(shí)間是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。不同的實(shí)驗(yàn)室采用胰酶的濃度從0.050.25不等，本實(shí)驗(yàn)室采用0.0625的胰蛋白酶濃度能獲得高產(chǎn)量、高活力的心肌細(xì)胞。胰蛋白酶濃度過高時(shí),心肌組織中細(xì)胞及間質(zhì)均受到影響,極易把組織消化成為透明粘稠狀液體,使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞死亡率增加或喪失貼壁才能及搏動(dòng)才能；胰蛋白酶濃度過低時(shí)，心肌組織消化缺乏，細(xì)胞聚集成團(tuán)，無法分清細(xì)胞邊

10、界，難以進(jìn)展形態(tài)學(xué)觀測。不同實(shí)驗(yàn)室采用的分次消化時(shí)間從58in不等，我們在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)分次消化時(shí)間為8in時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞活力較理想。有的實(shí)驗(yàn)室在心肌消化過程中將心肌消化到透明為止，而我們發(fā)現(xiàn)隨著總消化時(shí)間的延長細(xì)胞活力呈下降趨勢，本實(shí)驗(yàn)室將總的消化時(shí)間控制在20in左右。細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌原那么：在進(jìn)展細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),組織材料來源、培養(yǎng)液、血清、消化酶、手術(shù)器械、培養(yǎng)板等,要嚴(yán)格按無菌實(shí)驗(yàn)要求準(zhǔn)備,培養(yǎng)過程中詳細(xì)操作的每一步都應(yīng)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)原那么和無菌要求。心肌細(xì)胞的觀察、拍照時(shí)間不可過長，頻率不可太高，否那么能增加污染概率。心肌細(xì)胞生長適宜的ph值：心肌細(xì)胞生長的最適ph值為7.27.4，因

11、此培養(yǎng)液、胰蛋白酶、d-hanks液ph值均應(yīng)在此范圍內(nèi)。當(dāng)ph低于6.8時(shí),對心肌細(xì)胞生長會(huì)有抑制作用；當(dāng)ph值大于7.6時(shí)，心肌細(xì)胞生長亦會(huì)受到抑制，且搏動(dòng)會(huì)減弱。成纖維細(xì)胞對心肌細(xì)胞培養(yǎng)的影響：細(xì)胞培養(yǎng)中的非心肌細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更容易貼壁且具有分裂增殖才能，大量成纖維細(xì)胞的存在不僅限制心肌細(xì)胞的活動(dòng),而且其分泌物也影響心肌細(xì)胞的形態(tài)構(gòu)造和生理功能5。本實(shí)驗(yàn)采用90in差速貼壁和brdu可得到較純的心肌細(xì)胞。brdu可顯著抑制心肌細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)brdu對心肌細(xì)胞無毒性與抑制作用,可使培養(yǎng)細(xì)胞中心肌細(xì)胞所占比例從4550進(jìn)步到85906。心肌細(xì)胞的接種密

12、度：心肌細(xì)胞的接種密度不僅影響別離細(xì)胞的分化表型特征,而且影響心肌細(xì)胞的生存時(shí)間。心肌細(xì)胞之間聯(lián)絡(luò)可促進(jìn)細(xì)胞自發(fā)活動(dòng)的形成。假如心肌細(xì)胞接種密度太低,細(xì)胞間難進(jìn)展信息交流,細(xì)胞生長不良、細(xì)胞難于生存；假如細(xì)胞密度太高,那么易發(fā)生營養(yǎng)不良，且許多細(xì)胞難于貼壁生長,在更換培養(yǎng)液時(shí)容易被喪失7。本實(shí)驗(yàn)室的心肌細(xì)胞接種密度一般為5105細(xì)胞/l,此時(shí)細(xì)胞生長良好,收縮明顯而有力,搏動(dòng)頻率多在70120次/in。綜上所述，心肌細(xì)胞增殖才能低，大多實(shí)驗(yàn)來源于心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，因此原代培養(yǎng)的成功與否直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，而進(jìn)步心肌細(xì)胞的產(chǎn)量和活力是心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。本研究介紹的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，

13、細(xì)胞貼壁快、搏動(dòng)早、產(chǎn)量高，活力好而且操作簡便、本錢低，是一種較為理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。【參考文獻(xiàn)】1hararyl，farlyb.invitrstudiesfsingleislatedbeatingheartellsj.siene,1960，131:1674-1675.2sipsnp，savins.differentiatinfratyytesinsingleellulturesithandithutprliferatingnnyardialellsj.irares，1982，50：101-106.3suzukit，hta，hshh.serufree，heiallydefinededi

14、utevaluatethedireteffetsfgrthfatrsandinhibitrsnprliferatinandfuntinfnenatalratardiausleellsinulturej.invitr，1989，25：601-606.4bera，vandereesg，ndergej，etal.separatinfnenatalratventriularyytesandnn|yytesbyentrifugalelutriatinj.eurj，phy，2002，444(3)：452-456.5iragli，gaudesiusg，rhrs.eletrtnidulatinfardiaipulsendutinbyyfibrblastsj.irares，2022，98(6)：801-810.6sunh，hartierd，leblann，raellularaliuh