1、第十五章 免疫學應用教學目的：掌握：基于抗原抗體反應的檢測方法；免疫細胞的檢測方法 ；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。理解：基于抗原-抗體反應的特點及影響因素；免疫分子的檢測原理；免疫細胞的檢測方法與原理；以抗體、細胞和細胞因子為基礎的免疫治療了解：免疫分子的檢測原理；免疫學診斷的原理、常用的免疫功能檢測指標；免疫治療制劑的類型和作用機制 教學重點：基于抗原抗體反應的檢測方法及原理；人工（自然）主動免疫、人工（自然）被動免疫的概念。教學難點：抗原-抗體反應的特點及影響因素。使用教材：醫(yī)學免疫學（第二版），龔非力主編，科學出版社，2019年。參考教材：醫(yī)學免疫學（第五版），金伯

2、泉主編， 人民衛(wèi)生出版社，2019年；/主要內容第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學預防第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法抗原-抗體反應：指抗原與相應抗體在體內、外發(fā)生高度特異性結合反應。由于實驗所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學反應（serological reaction)應用：用已知抗原檢測未知抗體；用已知抗體檢測未知抗原：定性或定量檢測體內各種分子；用已知抗體檢測半抗原物質。（一）特異性和交叉反應 特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產生的抗體結合。分子基礎：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構型的互補性。一、抗原-抗體反應的特點交叉

3、反應（cross reaction）性：若兩種抗原分子有一個或數個相同（或相似）的決定基，則針對一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應。 結合價： 天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個抗體分子結合，為多價。單體形式的抗體分子有兩個Fab段，能結合兩個相同的抗原決定基，為兩價。前帶現象（prozone）和后帶現象(postzone) Ab過剩和Ag過剩（二）抗原-抗體結合的帶現象與可見性前帶現象（prozone）和后帶現象(postzone)Ab過剩和Ag過剩比例合適： 若抗原、抗體的數量比例合適，抗體分子的兩個Fab段分別與兩個抗原決定基結合，相互交叉連接成網格狀復合體，則反應體系中

4、基本不存在游離的抗原或抗體，此時形成肉眼可見的反應物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。抗原-抗體反應為分子表面的非共價結合，結合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學活性。根據此特點，可借助親和層析法純化抗原或抗體。（三）可逆性（一）電解質 抗原和抗體有對應的極性基團，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質的存在使抗原-抗體復合物失去電荷而凝聚，出現可見反應，故免疫學試驗中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。二、抗原-抗體反應的影響因素（二）酸堿度 抗原抗體反應的最適pH是6-

5、8。（三）溫度最適溫度為37。有些例外，如冷凝集素在 4左右與紅細胞結合最好，20以上反而解離。 （四）抗原和抗體的性質 抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應的關鍵因素。 此外，抗原理化性質、抗原決定基多寡和種類等均可影響抗原-抗體反應。 抗體分子上一個抗原結合點與對應的抗原決定基之間的結合能力親和力(affinity)一個抗體分子與整個抗原分子間的結合強度親合力(avidity) 根據抗原的性質、結合反應的現象、參與反應的成分等因素分類：（一）凝集反應（二）沉淀反應（三）補體參加的反應（四）免疫標記技術三、Ag-Ab反應的基本檢測方法顆粒性抗原（細菌或細胞等）與相應抗體結合，在一定條件下

6、，出現肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(agglutination) 。 （一）凝集反應（Agglutination Tests）1直接凝集（direct agglutination) ： 細菌或紅細胞與相應抗體直接反應，可出現細菌或紅細胞凝集現象。2間接凝集（indirect or passive agglutination) ：檢測針對可溶性Ag的Ab3間接凝集抑制試驗 (direct agglutination inhibition test)4. 協同凝集試驗（co-agglutination test）1直接凝集YYY+Qualitative agglutination test（定性

7、凝集實驗）Ag or Ab Applications Blood typing（血型測定） Bacterial infections（細菌性感染） Practical considerations Easy（簡便） Semi-quantitative（半定量）2、間接凝集Definition - agglutination test done with a soluble antigen coated onto a particleApplicationsMeasurement of antibodies to soluble antigensYYY+3、間接凝集抑制試驗應用：可用于檢測抗原或

8、抗體（如早孕的檢測），其 靈敏度高于一般間接凝集試驗。各種凝集反應示意圖Ag-Ab反應的基本檢測方法（一）凝集反應（二）沉淀反應（三）補體參加的反應（四）免疫標記技術Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細菌濾液等）與相應抗體結合，在一定條件下，形成出現肉眼可見的沉淀物的現象稱為沉淀反應。該反應多用半固體瓊脂凝膠作為介質進行瓊脂擴散或免疫擴散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散，在比例合適處相遇即形成可見的白色沉淀。（二）沉淀反應（Precipitation Tests）1單向免疫擴散(single immunodiffusion)2雙向免疫擴散(double immunodiffu

9、sion)3免疫電泳(immunoelectrophoresis)4免疫比濁(immunonephelometry) （二）沉淀反應單向免疫擴散(single immunodiffusion)雙向免疫擴散(double immunodiffusion) 單擴與雙擴原理Ag-Ab反應的基本檢測方法（一）凝集反應（二）沉淀反應（三）補體參加的反應（四）免疫標記技術用熒光素、酶、放射性核素或化學發(fā)光物質等標記抗體或抗原，進行抗原-抗體反應的檢測，是目前應用最為廣泛的免疫學檢測技術。標記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點。（四）免疫標記技術（I

10、mmunolabelling technique） 此法乃用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中抗原反應，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復合物散發(fā)熒光，借此對抗原進行定性或定位。 1免疫熒光法(immunofluorescence,IF)（1）直接熒光法：熒光素直接標記抗體，對標本進行檢測。該法優(yōu)點是特異性高，缺點是檢查任一抗原均須制備相應熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標本中抗原結合，再用熒光素標記的二抗進行檢測。該法優(yōu)點是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應亦增強。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示Mouse kidney sectionLa

11、minin - green-fluorescent Qdot 565 IgG CD31- red-fluorescent Qdot 655 IgG Nuclei - blue-fluorescent Hoechst 33342ControlTSLPTSLP - AlexaFluor 488 Nuclei - propidium iodide HASMC 此法將抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，借助酶作用于底物的顯色反應判定結果。應用酶標測定儀測定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達ng/ml甚至pg/ml水平。常見的標記物為：辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP） 酶

12、免疫測定(enzyme immunoassay, EIA)常用的方法如下：（1）酶聯免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) （2）免疫細胞或組織化學（immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICC or IHC)1） ELISA是酶免疫測定中應用最廣的技術，用于測定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點：靈敏度高、操作簡便、穩(wěn)定性強，可自動化檢測，從而被廣泛用于檢測多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細胞因子等。雙抗體夾心法：用于檢測特異性抗原。該試驗所用的包被抗體與酶標抗體應分別針對不同

13、抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應無交叉反應。間接法：用于檢測特異性抗體。用已知抗原包被固相，加入待檢血清標本，再加酶標記的二抗，加底物觀察顯色反應。ELISA分類間接法圖示ELISA反應過程動畫演示2)酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)生物素（biotin）是廣泛分布于動、植物體內的一種生長因子，又稱輔酶R或維生素H。親和素(avidin)是卵白及某些微生物中的一種蛋白質，由4個亞單位組成。生物素與親和素間具有高度親和力，且均能偶聯抗體、抗原和辣根過氧化物酶而不影響其生物學活性。3）BAS（biotin avidin system)-ELISA：BAS-ELISA 應用酶標記的抗

14、體與組織或細胞抗原發(fā)生反應，結合形態(tài)學觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位。4）免疫細胞或免疫組化技術ICCIHC 乃用放射性核素標記抗原或抗體進行免疫學檢測。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應的特異性，檢測靈敏度達pg水平。常用于標記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。 該法常用于測定微量物質，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。 3放射免疫測定法(radioimmunoassay, RIA)化學發(fā)光免疫分析 將發(fā)光物質（如吖啶酯、魯米諾等）標記抗原或抗體，發(fā)光物質在反應劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分

15、析儀測定光子產量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。 該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質（甲狀腺素等激素）。 該法又稱Western印跡法，其結合凝膠電泳與固相免疫技術，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質轉移至固相載體，再應用酶免疫、放射免疫等技術進行檢測。 該法能對分子大小不同的蛋白質進行分離并確定其分子量，常用于檢測多種病毒抗體或抗原。免疫印跡法(immunoblotting)免疫印跡法第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學預防 一、 淋巴細胞及亞群的分離外周血單個核細胞(PBMC)的分離：葡聚糖泛影葡胺（即淋巴細胞分離液）密度梯度離心法淋巴細

16、胞亞群的分離 淋巴細胞為不均一的群體，可借助其表面標志及功能差異而分為不同的群和亞群。 1尼龍棉分離法 2E花環(huán)分離法 3洗淘法 4流式細胞術(flow cytometry，FCM) 5磁珠分離技術E花環(huán)實驗磁珠分選Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies二、免疫細胞功能的測定 1. T細胞功能測定：(1) 細胞增殖(轉化)試驗： 可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類。 * 絲裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破傷風類毒素、PPD和白色念珠菌等；淋巴細胞增殖實驗(2) T細胞介導的細胞毒試

17、驗：CTL (1) B細胞增殖(轉化)試驗 (2) 溶血空斑形成試驗 (3) 酶聯免疫斑點法(ELISPOT): 2. B細胞功能判定溶血空斑實驗第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學預防 在體外用已知抗原檢測相應抗體：見前述 用已知抗體對各類免疫球蛋白作定性、定量測定：檢測血清含量高的IgG、IgA和IgM時，可用免疫比濁法；檢測IgD和IgE選用ELISA、RIA等靈敏度高的方法。診斷免疫球蛋白異常性疾?。ㄈ绻撬枇觥⑿月摕o丙種球蛋白血癥等），可用免疫電泳等方法。一、免疫球蛋白的測定 了解體內補體激活狀況，輔助有關疾病的診斷。對血清含量高的C

18、3、C4、B因子等，可用免疫比濁法，其他含量低的成分則借助ELISA、RIA等方法。血清總補體活性測定常采用50%補體溶血法（CH50），其原理是：用SRBC和兔抗SRBC作為抗原抗體復合物，通過經典途徑激活待檢血清中的補體，導致SRBC溶解。若待檢血清補體含量減少或成分缺失，則影響溶血結果。二、補體測定（一）免疫學測定法以細胞因子作為抗原，用相應抗體進行定量或半定量檢測。對于分泌性細胞因子，常用方法為雙抗體夾心法ELISA、RIA、ELISPOT、免疫印跡法等方法檢測。對于胞內細胞因子，采用FCM免疫熒光技術檢測三、細胞因子（CKs）檢測（二）生物活性測定法根據細胞因子特定的生物學活性，借助

19、相應指示系統，如選用各種依賴性細胞株或靶細胞，同時與標準品對照測定，從而得知樣品中細胞因子活性水平，一般以活性單位（U/ml）表示。 （三）分子生物學測定法具體方法為聚合酶鏈反應（PCR）、實時定量PCR等。 第一節(jié)基于Ag-Ab反應的檢測方法第二節(jié)免疫細胞的檢測第三節(jié)免疫分子的檢測第四節(jié) 免疫學預防一、免疫學預防 免疫學預防（immunoprophylaxis）是指通過人工刺激機體產生或直接輸入免疫活性物質，從而特異性清除致病因子，達到預防疾病的目的。免疫包括：先天免疫：生物體在長期種系發(fā)育和進化中逐漸形成的一系列防衛(wèi)機制。特異性免疫：個體在生命過程中接受抗原刺激后主動產生或被動獲得的。特異

20、性免疫獲得方式有兩種： 1、自然免疫（natural immunization) 自然主動免疫：指機體受到各種病原體隱性或顯性感染后主動產生的特異性免疫。自然被動免疫：指機體經胎盤或初乳被動獲得的特異性免疫。2、人工免疫（artificial immunization） 即免疫學預防，指采用人工方法，將疫苗、類毒素或含特異性抗體和細胞的免疫制劑接種于人體，以增強宿主的抗病能力。人工主動免疫人工被動免疫人工主動免疫(artificial active immunization)：指給機體接種抗原性物質如疫苗、類毒素等，刺激機體免疫系統產生特異性免疫力的方法。人工被動免疫(artificial p

21、assive immunization)：指給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細胞因子等制劑,使受者迅速獲得特異性免疫力的方法。 人工自動免疫與人工被動免疫的比較人工自動免疫人工被動免疫產生免疫力的物質抗原（疫苗、類毒素、瘤苗等）抗體、活化的淋巴細胞、細胞因子等發(fā)揮作用的潛伏期較長，約24周短，無需誘導期、立即發(fā)揮作用免疫力維持時間較長，約半年數年較短，數周數月主要用途預防傳染性疾病治療腫瘤傳染性疾病的治療或緊急預防，調節(jié)機體免疫功能，治療腫瘤人工主動免疫的接種物疫苗（Vaccine）：細菌，病毒，螺旋體，立克次體和類毒素等抗原性生物制品統稱為疫苗。理想疫苗的標準：安全；有效；實用 分類： 1、死疫苗（death vaccine）:選用免疫原性強的微生物標準株經大量培養(yǎng)后，用物理或化學方法將其殺死或滅活而制成的預防制劑。如霍亂、百日咳、傷寒、鉤端螺旋體疫苗。 優(yōu)點：主要誘導特異性抗體產生，安全 缺點：不能繁殖，需多次刺激，注射局部和全身反應嚴重2、減毒活疫苗（live-attenuated Vaccine）用人工定向變異或從自然界篩選得到的毒力高度減弱或基本無毒的病原微生物制成的預防制劑。優(yōu)點：一次免疫即可獲得長久免疫力，類似自然狀態(tài)下的輕型或隱性感染。誘導體液免疫和細胞免疫。缺點：不易保存，存在回復突變的危險如卡介苗，牛痘，麻疹等死疫苗