1、第五章植物無性系的快速繁殖第1頁，共55頁。植物無性系的快速繁殖分五個階段：第一階段，無菌培養(yǎng)物的建立 （外植體的建立）第二階段，誘導(dǎo)外植體生長與分化第三階段，試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)第四階段，壯苗與生根第五階段，小植株的移栽馴化第2頁，共55頁。無菌培養(yǎng)物的建立植物材料的準備源植物的預(yù)處理植物材料的采集植物材料的消毒無菌操作初代培養(yǎng)物初代培養(yǎng)建立起來的條件初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題及對策 第3頁，共55頁。源植物的預(yù)處理為獲得健康、無菌的植物材料，需要在材料采集之前進行預(yù)處理，即將源植株栽培在特殊管理的大田或溫室，或進行室內(nèi)盆栽如果必須從大田中采集植物材料，則須做到采集未休眠或綻放前帶芽鱗的芽用塑

2、料布包裹將用的莖段或植物體部分，待長成后采集用最幼嫩的枝條將枝條采回后用流水沖洗。 第4頁，共55頁。植物材料的采集選擇植物材料應(yīng)遵循的原則：1、外植體再生能力強；2、遺傳穩(wěn)定性好；3、外植體來源豐富；4、外植體滅菌容易。第5頁，共55頁。植物材料的采集植物材料的采集要考慮消毒的難易程度天氣、季節(jié)、生長環(huán)境、生長狀態(tài)、取材部位等培養(yǎng)目的組織培養(yǎng)中的反應(yīng)性即植物材料自身因素對培養(yǎng)中生長和發(fā)育的影響，也就是培養(yǎng)的難易程度第6頁，共55頁。培養(yǎng)目的從培養(yǎng)目的講苗木快速無性繁殖：多采用腋芽莖段、原球莖或莖尖（分生組織）作起始培養(yǎng)材料生產(chǎn)單倍體植株：多采用花粉(藥)培養(yǎng)或未受精胚珠培養(yǎng)生產(chǎn)植物次生代謝物

3、：常用活體中該天然物質(zhì)含量最豐富的部位游離的細胞作起始培養(yǎng)材料 第7頁，共55頁。組織培養(yǎng)中的反應(yīng)性基因型源植株年齡組織或器官的年齡生理狀態(tài)健康狀態(tài)取材季節(jié)生長條件取材位置外植體大小損傷外植體的極性和接種方法預(yù)處理 第8頁，共55頁?；蛐碗p子葉植物常比單子葉植物容易獲得再生植株，而裸子植物的再生能力則非常有限 同屬不同種，甚至同種不同品種，器官分化和植株再生能力也有很大的差異 第9頁，共55頁。源植株年齡植物的胚性組織常具有較高的再生能力隨著植物年齡的增加，其再生能力會隨之而下降植物組織培養(yǎng)常選用幼齡植物的組織或器官作外植體第10頁，共55頁。組織或器官的年齡幼嫩柔軟(非木質(zhì)化)組織一般比年

4、老的木質(zhì)化的組織更易于組織培養(yǎng)在開花期，植物的再生能力都得到提高第11頁，共55頁。生理狀態(tài)外植體的生理狀態(tài)顯著影響著細胞分裂狀態(tài)一般而言，處于植物營養(yǎng)生長狀態(tài)的外植體比生殖生長時具有更強的再生能力第12頁，共55頁。健康狀態(tài)從健康的植株上取材，培養(yǎng)成功的可能性顯然遠遠大于不健康的植株。在為營養(yǎng)繁殖選取外植體時，源植株的健康狀態(tài)對消毒的難易程度、培養(yǎng)的難易程度及再生植株的表現(xiàn)都有很大影響，所以要慎之又慎。 第13頁，共55頁。取材季節(jié)從大田栽培或野生的植物上采集外植體時，要考慮取材時的季節(jié)因素冬季是否嚴寒(嚴寒有利于打破休眠)夏季是否干燥(水分供應(yīng)不充足，就生長得差)生長季節(jié)是否光照充足(光照

5、不足，營養(yǎng)物質(zhì)貯備較少)第14頁，共55頁。生長條件自然晝長和自然光照條件下生長的植物材料同溫室中甚至試管中離體培養(yǎng)的植物的培養(yǎng)反應(yīng)有所不同與大田植物相比，生長在溫室中的植物更易伸長和黃化，在培養(yǎng)中也更容易再生第15頁，共55頁。取材位置從樹體上游分離外植體時，位置越靠上，不定根發(fā)生的可能性就越小，這是由于上部要比下部更為成熟按照植物生理學(xué)的觀點，沿植物主軸，愈向上生長時間愈短，但其生理或發(fā)育特性則愈近發(fā)育成熟，也就愈可能形成花器官；而愈靠近下部則愈近發(fā)育上的幼態(tài)，不定根發(fā)生能力也愈強 第16頁，共55頁。外植體大小離體部分愈大，就愈易誘導(dǎo)其生長和再生，同時添加的營養(yǎng)和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的依賴性

6、也有所下降分生組織越大，存活率越高，卻對于脫除病毒不利，外植體愈小的旺盛生長的分生組織區(qū)域，病毒含量就越小或無，脫除病毒的機會也就越大切取大小不同的傷口面積同無損傷部分的比例也應(yīng)加以考慮，因為它會影響到再生能力 第17頁，共55頁。損傷損傷組織對培養(yǎng)反應(yīng)影響大，因為損傷區(qū)域可以擴大對營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的吸收，同時也增加乙烯的產(chǎn)生第18頁，共55頁。外植體的極性和接種方法外植體的極性也顯著影響著培養(yǎng)中的反應(yīng)，極性同某些生理活性物質(zhì)的濃度梯度有關(guān)外植體的接種方式有兩種：有時極性方式直立，非極性方式倒置。有時非極性接種方式根和芽再生比極性接種方式更容易，也更快第19頁，共55頁。預(yù)處理原初外植體

7、可通過預(yù)處理來改變其生理狀態(tài)低溫處理將外植體置于一定的溶液中(含糖、BA、GA3等或不同濃度的BA)利用注射的方法注入生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 第20頁，共55頁。植物材料的消毒消毒劑使用濃度去除難易消毒時間（分）效 果次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好過氧化氫1012最易515好溴 水12易210很好硝酸銀1較難530好氯化汞0.11較難225最好抗生素450mg/L中3060較好酒 精7075易數(shù)秒5分好漂白粉飽 和易530很好第21頁，共55頁。植物材料的消毒外植體消毒的步驟：外植體取材 自來水沖洗 70酒精表面消毒（2060s） 無菌水沖洗 消毒劑處理 無菌水充分洗凈 備用第22頁，

8、共55頁。植物材料的消毒莖段、莖尖或葉柄、葉片表面消毒地下根莖消毒果實和種子消毒花藥或未授精胚珠等消毒注：為了增強消毒效果，采用如下方法：將植物材料在滅菌前用清潔的流水(或自來水)沖洗0.52小時向消毒劑中加入1滴或數(shù)滴吐溫(Tween)20或80，濃度為0.08一0.12，粘著劑可降低表面張力，更好地同材料表面接觸在消毒過程中攪拌或振蕩在真空中進行消毒，可使氣泡排除，滅菌更有效多種消毒劑多次消毒處理或復(fù)合消毒處理 第23頁，共55頁。無菌操作無菌操作室或接種室消毒工作人員的個人清潔衛(wèi)生接種工作臺、接種工具、容器等的消毒接種操作要領(lǐng)第24頁，共55頁。初代培養(yǎng)建立起來的條件保證無菌條件合適選擇

9、好合適的作物種類、品種及培養(yǎng)的部位選擇好合適的培養(yǎng)基，激素及其他添加物掌握適宜的培養(yǎng)條件技術(shù)過關(guān) 第25頁，共55頁。初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題及對策污染操作污染分為細菌污染和真菌污染外植體自身帶菌導(dǎo)致的污染由于表面滅菌不徹底或外植體內(nèi)部帶菌所致 褐變 褐變的概念及影響因素 褐變的防止方法第26頁，共55頁。細菌污染細菌污染表現(xiàn)：在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或渾濁的水跡狀，有時甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀。原因：主要是由于工作人員使用未經(jīng)充分消毒的工具、或由于呼吸排除的細菌、或操作人員用手接觸材料或器皿的邊緣，使微生物落入培養(yǎng)基中，有時也會因剪取某一帶菌材料后用具又未徹底滅菌，造

10、成繼續(xù)污染。第27頁，共55頁。真菌污染真菌污染表現(xiàn)：在培養(yǎng)過程中，一般35天發(fā)現(xiàn)菌絲，既而很快出現(xiàn)灰、白、黃、綠等孢子。原因：空氣污染以及取放瓶塞揚起的灰塵和真菌孢子落入器皿中造成。第28頁，共55頁。褐變的概念及影響因素概念褐變是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化的發(fā)生是由于組織中多酚氧化酶被激活，酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料組織中蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其它酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長受阻。影響因素基因型材料的生理狀態(tài)培養(yǎng)基成分培養(yǎng)時間第29頁，共55頁。褐變的防止方法選擇適當?shù)耐庵搀w，掌握適宜的

11、采芽時間外植體用流水沖洗30分鐘以上，在接種前將外植體在無菌水中浸泡處理降低對外植體的切割損傷，或在無菌水中切割降低培養(yǎng)基中無機鹽濃度；缺省生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可減少酮類物質(zhì)分泌和氧化使用液體培養(yǎng)基可以迅速稀釋外植體傷口處分泌出的有毒物質(zhì)在培養(yǎng)基中加入活性炭在培養(yǎng)基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP加入抗氧化劑如檸檬酸、維生素C、L半胱氨酸、硫脲在培養(yǎng)基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸鈉連續(xù)轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上有時可緩慢阻止色素的形成由苗芽基部光激活引起的褐化可通過將苗芽基部處于黑暗狀態(tài)得以消除控制光溫條件，避免過高第30頁，共55頁。誘導(dǎo)外植體生長與分化再分化過程的類型大體上可分為

12、以下幾類頂芽和腋芽的發(fā)育不定芽的發(fā)育體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育原球莖的發(fā)育原球莖是一種類胚組織，可理解為縮短的、呈珠粒狀的，由胚性細組成的類似嫩莖的器官。大部分蘭花的培養(yǎng)屬于這一類型第31頁，共55頁。頂芽和腋芽的發(fā)育頂芽和腋芽的發(fā)育方式主要有以下兩種無菌短枝型：又稱節(jié)培法，或微型扦插法，是將待繁殖的材料，剪成單芽莖段，轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基，一定時間后可成苗，再剪成單芽莖段，繼代又可成苗（圖）。叢生芽增殖型：莖尖或帶芽莖段在外源細胞分裂素的作用下會使休眠芽啟動生長，形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀結(jié)構(gòu)（圖）。注：通過頂芽和腋芽發(fā)育再生植株這種方法為多數(shù)園藝家們所推崇，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，是最

13、能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式第32頁，共55頁。不定芽的發(fā)育有兩種情況一種是不定芽的產(chǎn)生不經(jīng)過愈傷組織階段，不定芽是從外植體受傷或沒有受傷的部位直接分化出來，這種植株的再生方式，稱器官型。另一種是不定芽的產(chǎn)生要經(jīng)過愈傷組織階段，即從外植體上誘導(dǎo)出愈傷組織，從愈傷組織上產(chǎn)生不定芽的再生方式，稱器官發(fā)生型。注：通過這種方式繁殖，繁殖率極高，同時也可創(chuàng)造有益的突變體。但極易發(fā)生變異，常常不能保持優(yōu)良品種的遺傳特性，在快繁中一般要避免此種器官發(fā)生方式。 第33頁，共55頁。試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)植物材料在容器中培養(yǎng)一段時間后，往往需要轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上去生長。因為：培養(yǎng)基消耗盡植物材料

14、在培養(yǎng)容器中已占盡生長空間需進一步增殖(轉(zhuǎn)到同樣配方的培養(yǎng)基上)植物材料轉(zhuǎn)入下一階段生長或另一種器官分化(轉(zhuǎn)到不同配方的培養(yǎng)基上)由于無機鹽和瓊脂濃度過高而導(dǎo)致培養(yǎng)基干化由于pH值下降而引起培養(yǎng)基流體化防止褐化現(xiàn)象發(fā)生而轉(zhuǎn)接第34頁，共55頁。試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題玻璃化現(xiàn)象馴化作用 試管繁殖速率及其計算第35頁，共55頁。試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)試管苗繼代培養(yǎng)過程中分化再生能力衰退 原因：1、愈傷組織培養(yǎng)逐漸喪失了成器官中心；2、內(nèi)源激素的減少；3、染色體畸變。 解決措施：增加外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；篩選具有形態(tài)分生能力細胞團；縮短繼代時間；重新建立細胞系。影響試管苗繼代培養(yǎng)的

15、因素植物材料的影響培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件繼代培養(yǎng)時間長短季節(jié)的影響解決措施第36頁，共55頁。培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載（P56）1、愈傷組織誘導(dǎo)率（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）100% 愈傷組織生長量培養(yǎng)一定時間后愈傷組織干重或鮮重接種時愈傷組織干重或鮮重2、胚狀體誘導(dǎo)率（產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）100%3、芽分化率（產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)） 100%4、發(fā)根率（發(fā)根芽數(shù)/培養(yǎng)芽數(shù)）100%第37頁，共55頁。玻璃化現(xiàn)象玻璃化現(xiàn)象(vitrification) 是一種異常的生理現(xiàn)象。玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)時出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管苗其解剖特點為：整株植物矮小腫脹，呈半透明狀。有時

16、發(fā)育出大量短而粗的莖，節(jié)間很短或幾乎沒有節(jié)間。輸導(dǎo)組織雖可看到，但導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。葉片厚而狹長，有時基部較寬。葉片皺縮或縱向卷曲，脆弱易折碎。葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)或蠟質(zhì)發(fā)育不完全，無功能性氣孔器。玻璃化葉片不具有柵欄組織，僅有海綿組織。第38頁，共55頁。玻璃化現(xiàn)象玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因一般而言，培養(yǎng)條件與玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān).培養(yǎng)條件引起試管苗碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理異常。降低和減輕玻璃化現(xiàn)象采取的措施增加瓊脂和(或)糖濃度改善培養(yǎng)容器的氣體交換改變培養(yǎng)基的大量鹽類降低BA水平增強光照，適當降低溫度避免采用容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象的瓊脂種類采用液固兩相培養(yǎng)基第39頁，共55頁。玻

17、璃化苗發(fā)生的機理 試管苗玻璃化的產(chǎn)生是由于內(nèi)源激素乙烯在代謝調(diào)節(jié)中所起的關(guān)鍵性啟動作用。試管苗在脅迫培養(yǎng)環(huán)境中，如水勢不當，通氣不暢、生長調(diào)節(jié)劑濃度過高、溫度過高等，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。培養(yǎng)瓶空氣中過剩的乙烯抑制了試管苗體內(nèi)乙烯的生物合成，但誘發(fā)了其它激素質(zhì)和量的改變及酶類的變化；另外，培養(yǎng)瓶中氣體組成的改變，也影響磷酸戊糖途徑、光呼吸途徑的進行。 第40頁，共55頁。馴化作用馴化作用是指原先依賴于某種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)而生長的培養(yǎng)物，經(jīng)過一段時間的繼代培養(yǎng)后，不再需要這種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，即變成對該生長調(diào)節(jié)物質(zhì)自養(yǎng)的培養(yǎng)物的現(xiàn)象 馴化作用一般并非是永久性變化，有時培養(yǎng)條件變化也會逆轉(zhuǎn)馴化作用，所以馴化作用是

18、外遺傳變化。馴化作用可在繼代培養(yǎng)中自然發(fā)生，也可人為地改變培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)或逆轉(zhuǎn)這種馴化作用。 馴化作用可能是由于植物組織內(nèi)對該生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保護所致，組織對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)敏感性降低也可能是一種原因，也不排除上述幾個原因共同作用的結(jié)果。 第41頁，共55頁。試管繁殖速率及其計算試管苗增殖速率有理論計算和實際計算兩種理論計算是以接種一個芽或一塊增殖的培養(yǎng)物，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)看能得到多少個芽或苗，這樣推算出理論上一年能繁殖出多少個苗實際計算是接種一個芽或轉(zhuǎn)接一個苗，經(jīng)過一定的實際繁殖周期，看實際得到多少個成苗，然后再換算成每個周期實際繁殖的數(shù)量第42頁，共5

19、5頁。試管繁殖速率及其計算試管苗理論上一年能繁殖多少，可用下面的簡單公式計算：Y=mXn=m XnY=年繁殖數(shù)m =無菌母株苗數(shù)X=每個培養(yǎng)周期增殖的倍數(shù)n=全年可增殖的周期次數(shù)=365/每周期的天數(shù)第43頁，共55頁。壯苗與生根 壯苗材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流，使太細弱的材料達到壯苗的目的生根（離體生根和活體生根）第44頁，共55頁。離體生根壯苗后的單苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后即可生根。一般來說，多數(shù)植物的生根只需要一次培養(yǎng)，但有少部分植物的生根必須經(jīng)過多次培養(yǎng)才能達到目的。一般認為礦物元素濃度較高時有利于發(fā)展莖葉，而較低時有利于生根，所以多采用1/2或1/4量的MS培養(yǎng)基，全部去掉

20、或僅用很低的細胞分裂素，并加入適當?shù)纳L素。第45頁，共55頁?；铙w生根又稱試管外生根：芽苗先在生長素中快速浸蘸或在含有相對高濃度生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)510天，然后在溫室中栽入培養(yǎng)基質(zhì)中，并輔以高濕度環(huán)境，即經(jīng)常噴霧，幾天后，芽苗可自行生根。第46頁，共55頁。小植株的移栽馴化試管苗的特點1、根與輸導(dǎo)系統(tǒng)不通 ；2、在高濕、弱光和異養(yǎng)條件下分化和生長的葉，葉表保護組織不發(fā)達甚至完全沒有，易于失水萎焉。試管苗葉光合作用能力極低。 3、組織幼嫩、結(jié)構(gòu)較松散、細胞含水率高，機械組織不發(fā)達，容易發(fā)生機械損傷，對病蟲害特別敏感 第47頁，共55頁。小植株的移栽馴化一、試管苗煉苗1、瓶煉：試管苗在移植前必須對其進行高光強鍛煉，同時將瓶口包扎物打開，使試管苗慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，讓植株生長粗壯，增強小苗體質(zhì)以提高移苗成活率，這個過程叫做馴化或煉苗。 關(guān)鍵技術(shù)：1）生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的天數(shù)；2）生根的狀態(tài) ；3）煉苗時的光照強度 ；4）煉苗的時間 ；5）瓶苗開口也有技巧可言 第48頁，共55頁。小植株的移栽馴化2、盤煉：從瓶中小心取出試管苗，在20度左右的溫水中浸泡約10min