1、1定義：單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括置換、顛換

2、、缺失和插入。所謂轉(zhuǎn)換是指同型堿基之間的轉(zhuǎn)換,如嘌呤與嘌呤(G2A)、嘧啶與嘧啶(T2C)間的替換;所謂顛換是指發(fā)生在嘌吟與嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T)之間的替換。從理論上來看每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變異形式，但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換，二者之比為2：1oSNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T，原因是CG中的C常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000個(gè)堿基就有一個(gè)SNP，人類基因組上的SNP總量大概是3X106個(gè)。依據(jù)排列組合原理,SNP共可以有6種替換情況，即A/G、A

3、/T、A/C、C/G、C/T和G/T,但事實(shí)上，轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占多數(shù),而且是C2T轉(zhuǎn)換為主，其原因是CpG的C是甲基化的，容易自發(fā)脫氨基形成胸腺嘧啶T,CpG也因此變?yōu)橥蛔儫狳c(diǎn)。理論上講,SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個(gè)或4個(gè)等位多態(tài)性，但實(shí)際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的。這種變異可能是轉(zhuǎn)換（CT,在其互補(bǔ)鏈上則為GA），也可能是顛換（CA，GT，CG，AT）。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3,其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。Wang等的研究也證明了這一點(diǎn)。轉(zhuǎn)換的幾率高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘

4、基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。SNP在動(dòng)物基因組中分布廣泛,每一個(gè)核苷酸發(fā)生突變的概率大約為10-9。由于選擇壓力,SNP在單個(gè)基因、整個(gè)基因組中以及種群間的分布是不均勻的。SNP在非編碼區(qū)中要多于編碼區(qū),而且在編碼區(qū)也是非同義突變（有氨基酸序列的改變）的頻率比其他方式突變的頻率低得多4。而基因間,同一種基因中的編碼SNP（codingSNP,cSNP）的數(shù)目也不相同，可從029個(gè)不等。多項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同種族間SNPs的數(shù)目也是不同的,非洲人群及非裔種族中SNPs數(shù)量最多,而其他種群的SNPs要少得多,因此通過比較亞群間等位基因的頻

5、率將有助于闡明種族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（codingSNP,cSNP）比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5.但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。從對(duì)生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymouscSNP)，即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymouscSNP)，指堿基序

6、列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。先形成的SNP在人群中常有更高的頻率，后形成的SNP所占的比率較低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不盡相同，但大約有85%應(yīng)是共通的。2.SNP自身的特性：SNP數(shù)量多，分布廣泛。據(jù)估計(jì)，人類基因組中每1000個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP，人類30億堿基中共有300萬以上的SNPs.SNP遍布于整個(gè)人類基因組中，根據(jù)SNP在基因中的位置，可分為基因編碼區(qū)SNPs(Coding-regionSNPs，cSNPs)、基因周邊SNPs(

7、PerigenicSNPs，pSNPs)以及基因間SNPs(IntergenicSNPs，iSNPs)等三類。SNP適于快速、規(guī)模化篩查。組成DNA的堿基雖然有4種，但SNP一般只有兩種堿基組成，所以它是一種二態(tài)的標(biāo)記，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動(dòng)化技術(shù)篩選或檢測SNPs。3）SNP等位基因頻率的容易估計(jì)。采用混和樣本估算等位基因的頻率是種高效快速的策略。該策略的原理是：首先選擇參考樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測的混和樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，根據(jù)所得信號(hào)的比例確定混和樣本中各種

8、等位基因的頻率。4）易于基因分型。SNPs的二態(tài)性，也有利于對(duì)其進(jìn)行基因分型。對(duì)SNP進(jìn)行基因分型包括三方面的內(nèi)容：（1）鑒別基因型所采用的化學(xué)反應(yīng)，常用的技術(shù)手段包括：DNA分子雜交、引物延伸、等位基因特異的寡核苷酸連接反應(yīng)、側(cè)翼探針切割反應(yīng)以及基于這些方法的變通技術(shù)；（2）完成這些化學(xué)反應(yīng)所采用的模式，包括液相反應(yīng)固相支持物上進(jìn)行的反應(yīng)以及二者皆有的反應(yīng)。（3）化學(xué)反應(yīng)結(jié)束后，需要應(yīng)用生物技術(shù)系統(tǒng)檢測反應(yīng)結(jié)果。絕大多數(shù)疾病的發(fā)生與環(huán)境因素和遺傳因素的綜合作用有關(guān)，通常認(rèn)為是在個(gè)體具有遺傳易感性的基礎(chǔ)上，環(huán)境有害因素作用而導(dǎo)致疾病。不同群體和個(gè)體對(duì)疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學(xué)性狀（如對(duì)

9、藥物的反應(yīng)性等）有差別，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP.易感基因的特點(diǎn)是基因的變異本身并不直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生，而只造成機(jī)體患病的潛在危險(xiǎn)性增加，一旦外界有害因素介入，即可導(dǎo)致疾病發(fā)生。另外在藥物治療中，易感基因的變異造成藥物對(duì)機(jī)體的療效和副作用不同。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助于解釋個(gè)體的表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病，特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性以及對(duì)各種藥物的耐受性和對(duì)環(huán)境因子的反應(yīng)。因此，尋找和研究SNP已成為人類基因組計(jì)劃的內(nèi)容和目標(biāo)之一。1、多態(tài)性是一個(gè)群體概念，多態(tài)性指這個(gè)差異占群體的1%以上。否則就叫突變（小于1%）2

10、、SNP是多態(tài)性中的一種，只是進(jìn)一步限定了差異只是單堿基。3、SNP一般來說，是全部體細(xì)胞一樣的基因型（除開嵌合體）。4、突變一般不是一個(gè)個(gè)體全部細(xì)胞的變化。5、如果突變發(fā)生在生殖細(xì)胞，則可以遺傳，但是只要這個(gè)突變?nèi)簺]有達(dá)到總?cè)后w的1%，它就只是一個(gè)突變株/系。達(dá)到了1%就是多態(tài)性了。常用數(shù)據(jù)庫:HumanGeneMutationDatabase(HGMD)/ HYPERLINK http:/www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html http:/www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html/TheGenomeDatabase(GD)/Databa

11、seofSingleNuleotidePolymorphisms(dbSNP)/ HYPERLINK /SNP/ /SNP/HumanGenomeVariationDatabase(HGVbase)/http:/hgvbase.cgb.ki.se/TheSnpConsortium，LTD.(TSC)/3.SNP現(xiàn)有檢測技術(shù)人們對(duì)SNP的研究方法進(jìn)行了許多探索和改進(jìn)。SNP分析技術(shù)按其研究對(duì)象主要分為兩大類,即:對(duì)未知SNP進(jìn)行分析,即找尋未知的SNP或確定某一未知SNP與某遺傳病的關(guān)系。檢測未知SNP有許多種方法可以使用,如溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構(gòu)象多

12、態(tài)性(SSCP)、變性的高效液相色譜檢測(DHPLC)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)等,但這些方法只能發(fā)現(xiàn)含有SNP的DNA鏈,不能確知突變的位置和堿基類別,要想做到這一點(diǎn),必須對(duì)那些含有SNP的DNA鏈進(jìn)行測序。對(duì)已知SNP進(jìn)行分析,即對(duì)不同群體SNP遺傳多樣性檢測或在臨床上對(duì)已知致病基因的遺傳病進(jìn)行基因診斷。篩查已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析(ASO)、突變錯(cuò)配擴(kuò)增檢驗(yàn)(MAMA)、基因芯片技術(shù)(genechips)等。由于人類基因工程的帶動(dòng),許多物種都已開始了基因組的項(xiàng)目,并建立了大量數(shù)據(jù)庫,比較這些來自不同實(shí)驗(yàn)室不同個(gè)體的序列,就可

13、以檢測到SNP。SNP位點(diǎn)信息已知的情況下，選擇SNP的GENOTYPING的方法，主要根據(jù)你的經(jīng)費(fèi)情況設(shè)計(jì)，我分別給你分析一下現(xiàn)狀：A、一般實(shí)驗(yàn)室：經(jīng)費(fèi)一般，儀器不具備時(shí)，最多用的是以下兩種方法：1、基于PCR的方法，也叫AS-PCR,(ALLELE-SPECIFICPCR)的辦法。主要原理是利用引物在擴(kuò)增時(shí)3端相對(duì)高的BASE要求，進(jìn)行設(shè)計(jì)。這個(gè)方法是最便宜的，不需要酶切，一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。缺點(diǎn)：PCR對(duì)于3端的特異性在不同退火溫度時(shí)有出入，所以退火溫度的摸索很關(guān)鍵，否則假陽性擴(kuò)增是很容易的。另外，內(nèi)參照的設(shè)置也很重要，這個(gè)東西還是很有意思的。而且，所使用的引

14、物位置無法人為調(diào)整，只能放在SNP的5段。2、基于酶切分型。依靠限制性內(nèi)切酶的忠貞性進(jìn)行單SNP的分型。SNP突變與否，可能影響某個(gè)酶識(shí)別位點(diǎn)的存在或消失。通過酶切產(chǎn)物的電泳條帶，判斷SNP的突變的情況，即純和，野生純和,和雜和子。當(dāng)沒有直接可利用的酶切位點(diǎn)時(shí)，可以采用突變引物中個(gè)別BASE,從而湊成切點(diǎn)的設(shè)計(jì)，也叫做RG-PCR，restrictionsitegenerationPCR。B、有經(jīng)費(fèi)的實(shí)驗(yàn)室的方法：這里我寫幾個(gè)自己曾經(jīng)涉足過的方法，可行性比較強(qiáng)，但是需要相應(yīng)的經(jīng)費(fèi)支持和相應(yīng)的儀器，但是通量相對(duì)更高，效率更好：1、直接測序，基于PCR產(chǎn)物的直接sequencing的方法，比對(duì)序列

15、結(jié)果，就可以進(jìn)行SNP的識(shí)別和分析。2、分型質(zhì)譜，華大生物信息平臺(tái)那邊可以外接服務(wù)，提供PCR產(chǎn)物即可。3、pyro-sequencing，微測序，中科院遺傳所王瀝研究員那里有可以聯(lián)系的外接服務(wù)。4、D-HPLC，變性高效液相色譜法。北京可以去聯(lián)系做的地方不少，北京大學(xué)生科院有機(jī)器，另外北京大學(xué)腫瘤研究所也有機(jī)器，國家人類基因組陳標(biāo)那里也有一臺(tái)，需要做的話，拿著經(jīng)費(fèi)和他們聯(lián)系就可以，這個(gè)方法也很不錯(cuò)，價(jià)錢可以商量。5、還有些方法，如DNA芯片技術(shù)適合對(duì)于largescale的SNP的篩查，一般用于組學(xué)領(lǐng)域，可能不適用與您的情況。還有許多如熒光共振能量轉(zhuǎn)移等方法/探針雜交法等，并未在本領(lǐng)域中國內(nèi)

16、推廣，就不一一介紹了。1）測序主要發(fā)現(xiàn)新的SNP位點(diǎn)和比較集中的SNP位點(diǎn)，如hla區(qū)域，但成本較高，工作量大，不適合大樣本做疾病關(guān)聯(lián)分析。2)taqman探針結(jié)果比較可靠，國外文章也大量應(yīng)用，不過對(duì)于國內(nèi)成本偏高，同類還有snpshot技術(shù)，abi和貝克曼都相應(yīng)試劑盒。成本和成功率都比taqman要低。3)snp芯片國外大規(guī)模篩查疾病關(guān)聯(lián)分析常用，illumina和affy都有不同密度的成熟產(chǎn)品，單位點(diǎn)成本很低，但點(diǎn)較多，樣本多時(shí)也會(huì)很高花費(fèi)，但結(jié)果準(zhǔn)確，適合復(fù)雜疾病，有實(shí)力的項(xiàng)目組一般大型機(jī)器點(diǎn)在384-群基因組可以訂制，但成本會(huì)高；illumina開發(fā)了一臺(tái)小的芯片，極其適合1-384，

17、可以訂制，成本在2-5元/人點(diǎn)，但還沒有很成熟的流程，具體效果和成功率要進(jìn)一步看。4)剩下的就是傳統(tǒng)方法如酶切，PCR-SSCP等，也有雜志接受，但一般需要測序驗(yàn)證。缺點(diǎn)是工作量太大，結(jié)果不準(zhǔn)確，不是所有位點(diǎn)都可以做，但成本很低。目前已有多種方法可用于SNP檢測，如根據(jù)DNA列陣的微測序法、動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測。傳統(tǒng)的SNP檢測方法是采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO

18、)等。這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對(duì)SNP的檢測，但由于它們必須通過凝膠電泳進(jìn)行檢測，因此，距快速、高效、自動(dòng)化的目標(biāo)還相差甚遠(yuǎn)。傳統(tǒng)的RFLP只能檢測到SNP的一部分，測序技術(shù)既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且DNA鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)還容易造成人工假相，使測序結(jié)果出現(xiàn)偏差，不適宜于SNP的檢測；SSCP則很難滿足自動(dòng)化的需要，難以大規(guī)模開展工作。因此，這些方法均未被廣泛采用。DNA芯片技術(shù)是近年來新開發(fā)的一種DNA序列變異檢測工具。DNA芯片(DNAchip),也稱生物芯片(biochip),其大小與計(jì)算機(jī)上的CPU芯片相似，約1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作為載體基片，芯片上鋪了一層肉眼

19、看不見的DNA纖維“地毯”，即具有特定堿基序列的探針。待測基因經(jīng)提取后，被切成長短不一的片段，經(jīng)熒光化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記后，注射到嵌有芯片的載片上。由于DNA和探針雜交的程度與熒光強(qiáng)度相關(guān)，因此通過激光掃描，即可根據(jù)熒光強(qiáng)弱測出被檢測序列的變異。目前已有多家公司開展了對(duì)芯片的研究，例如美國的Affymetrix公司、NEN生命科學(xué)公司等。前者曾開發(fā)出BRCA1(乳癌基因1號(hào))芯片、p53芯片等，后者則在1張玻璃芯片上集成了多達(dá)2400個(gè)已知基因。此外，ResearchGenetics公司新近開發(fā)了1個(gè)集成有1500個(gè)SNP的DNA芯片，它涵蓋了人類基因組全部24條染色體，所提供的信息量至少等于或優(yōu)于目

20、前常用的300400個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的圖譜，檢測時(shí)只需0.5建的DNA樣品就可進(jìn)行1次全基因組的掃描。另外Transgenomic公司的WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)是高通量且較為準(zhǔn)確可靠的篩查未知、已知SNP的新方法。利用Transgenomic公司的WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)進(jìn)行SNP檢測平均每個(gè)樣本的費(fèi)用為$0.5。當(dāng)前SNP功能研究主要有以下幾方面：SNP的分型技術(shù)可分為兩個(gè)時(shí)代，一為凝膠時(shí)代，二為高通量時(shí)代。凝膠時(shí)代的主要技術(shù)和方法包括限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、寡核苷酸連接分析（OLA）、等位基因特異聚合酶鏈反應(yīng)分析（AS2PCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）、變性梯度凝

21、膠電泳分析（DGGE），雖然這些技術(shù)與高通量時(shí)代的技術(shù)原理大致一樣，但是由于它不能進(jìn)行自動(dòng)化，只能進(jìn)行小規(guī)模的SNP分型測試，所以必然會(huì)被淘汰。高通量時(shí)代的SNP分型技術(shù)按其技術(shù)原理可分為:特異位點(diǎn)雜交（ASH）、特異位點(diǎn)引物延伸（ASPE）、單堿基延伸（SBCE）、特異位點(diǎn)切割（ASC）和特異位點(diǎn)連接（ASL）5種方法。此外，采用特殊的質(zhì)譜法和高效液相層析法也可以大規(guī)模、快速檢出SNP或進(jìn)行SNP的初篩。近年來已經(jīng)在晶體上用“光刻法”實(shí)現(xiàn)原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA芯片法顯示出強(qiáng)大威力，對(duì)SNP的檢測可以自動(dòng)化、批量化，并已在建立SNP圖譜方面投入實(shí)際應(yīng)用。DNA芯片

22、法有望在片刻之間評(píng)價(jià)整個(gè)人類基因組。報(bào)告基因轉(zhuǎn)染技術(shù):這一技術(shù)主要用于研究啟動(dòng)子SNP對(duì)于mRNA轉(zhuǎn)錄效率，是通過觀察轉(zhuǎn)錄結(jié)局來判斷SNP是否具有功能。EMSA技術(shù)：通過在體外合成含SNP位點(diǎn)的寡核苷酸與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合，觀察結(jié)合的強(qiáng)度和效率,但是該技術(shù)由于只人工合成較短長度的寡核苷酸，沒有考慮SNP周圍遺傳背景環(huán)境的影響,因此在重復(fù)性和說服力上不強(qiáng)。ChiP技術(shù)：該技術(shù)通過超聲將染色體碎片化,再將碎片化的核酸與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，最后通過PCR技術(shù)觀察判斷結(jié)合的效率和強(qiáng)度，該技術(shù)克服了EMSA的一些缺點(diǎn),當(dāng)前做的文獻(xiàn)較多。5SNP產(chǎn)生功能的機(jī)制研究的個(gè)人之所見對(duì)大多數(shù)SNP而言，都由于位于一些

23、非編碼區(qū)域而不產(chǎn)生明顯的功能性影響，此時(shí)做SNP功能意義不大。啟動(dòng)子SNP研究是做的人最多的，相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)都比較成熟，其產(chǎn)生功能的機(jī)制主要是影響TF與啟動(dòng)子的的結(jié)合能力，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。編碼區(qū)SNP有同義和非同義2種，非同義突變由于會(huì)導(dǎo)致氨基酸的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能，特別是發(fā)生在結(jié)構(gòu)功能區(qū)域的SNP尤其重要，可是這方面的技術(shù)還存在瓶頸，做得相當(dāng)少，據(jù)我所知要用什么誘導(dǎo)點(diǎn)突變的方法再去評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)功能的。至于非同義突變，雖然沒有明顯的功能的分子機(jī)制，但是在遺傳學(xué)上可能因?yàn)榕c附近的其它致病基因的表達(dá)或者SNP連鎖，因此在流行病學(xué)上形成陽性結(jié)果一般以此解釋。4.內(nèi)含子區(qū)域SNP產(chǎn)生功能的分子

24、機(jī)制一般是與附近其它基因SNP連鎖或者可能影響mRNA的剪接從而影響蛋白質(zhì)的功能很多研究中做INTRON發(fā)現(xiàn)有陽性結(jié)果解釋不了，而且大多只是猜測。PYRO測序用于SNP基因分型其實(shí)是一種段片段焦磷酸測序技術(shù)，在測序引物的引導(dǎo)下，完成段片段（含snp）的測序，從而實(shí)現(xiàn)基因分型。缺點(diǎn)：不能檢測長片段，對(duì)于重復(fù)序列沒有辦法。原理簡介測序引物與單鏈，PCR擴(kuò)增的DNA模板相結(jié)合。然后將其與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，以及底物APS和熒光素一起孵育。四種dNTP之一被加入反應(yīng)體系，如與模扳配對(duì)，此dNTP與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來。而且

25、釋放出來的Ppi的量與和模板結(jié)合的dNTP的量成正比。ATPsulfurylase在adenosine5phosphosulfate存在的情況下催化PPi形成ATP，ATP驅(qū)動(dòng)luciferase介導(dǎo)的Luciferin向oxyluciferin的轉(zhuǎn)化，oxyluciferin發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)。光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測并由pyrogram反應(yīng)為峰。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。TP和未摻入的dNTP由Apyrase降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系。然后加入下一種dNTP。最終待測序列順序，即可從反應(yīng)光強(qiáng)的信號(hào)峰中讀出。在此過程之中有幾點(diǎn)值得注意的是，在體系中使

26、用的是dATPS而非dATP，因?yàn)閐ATPS不是熒光素酶的底物，而且DNA聚合酶對(duì)dATPS的催化效率更高。而且在系統(tǒng)之中，底物的濃度已經(jīng)最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的摻入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷雙磷酸酶的特異濃度，可以保證降解完全，使系統(tǒng)復(fù)原。RealtimePCR檢測SNP的方法是：針對(duì)目標(biāo)基因片段的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩條引物，這兩條引物的區(qū)別僅僅是末端的1-2個(gè)堿基不同，分別與突變位點(diǎn)匹配。共同的下游引物和探針。然后擴(kuò)增。就可以得到不同的CT值，根據(jù)CT值的不同，來確定基因類型。1、把蛋白序列對(duì)應(yīng)的核酸序列找到。2、根據(jù)核酸序列做BLAST(對(duì)dbSNP數(shù)據(jù)

27、庫 HYPERLINK /SNP/snpblastByChr.html)%e3%80%82 /SNP/snpblastByChr.html)。3、結(jié)果中，可以得到你的序列上所以已知的SNP。以編碼5-hydroxytryptamine(serotonin)receptor的HTR1A基因?yàn)槔冗M(jìn)入entrez,選擇gene選項(xiàng)，在NCBI中搜HTR1A基因，到如下圖界面，點(diǎn)基因縮略圖，然后點(diǎn)graphics。點(diǎn)擊后的界面如下。這里已經(jīng)很清楚地標(biāo)明了SNP所在的位置以及對(duì)應(yīng)的核酸與蛋白序列。但有一點(diǎn)要說明，我注意到這個(gè)基因編碼的蛋白序列與swissprot的序列有一些差別，很可能是收錄的版本不

28、同,或是有些序列是NCBI直接根據(jù)orf形成的.1,如果是檢測基因的所有已知的SNP,那么首先要去了解并查詢到這些SNP位點(diǎn)，SNP位點(diǎn)可以通過查詢dbSNP數(shù)據(jù)庫( HYPERLINK /SNP/)%e5%92%8c /SNP/)和TSC(TheSNPConsortium)數(shù)據(jù)庫(/)，可以獲知基因及上下游鄰近序列的SNP位點(diǎn)。2，至于挑選的原則，可以介紹一下HapMap的正規(guī)化標(biāo)準(zhǔn)：SNPSelectionCriteriaCategory1verifiedThiscontainsallSNPsforwhichwehaveallelefrequencyorgenotypingdata.Thi

29、sincludesSNPsfromtheTSCallelefrequencyproject,aswellasSNPscharacterizedbyJSNP.TheseSNPsweregeneratedfromthosersclustersinwhichatleastoneoftheSNPsintheclustercontainsgenotypeorallelefrequencydataandtheminorallelemusthavebeenseeninatleasttwoindividuals.Category2two-hitThesearetruedouble-hitSNPs,produc

30、edincollaborationwithJimMullikinandSarahHunt.Adouble-hitSNPmustbeseentwice,intwodifferentDNAsampleswhichmusthaveproducedtwoalleles.TSCtracedatawasonlyallowedtocontributeonehitperallelebecausetheindividualsourceDNAforatracecouldnotbeidentified.Category3jsnp-verified/perlegen-verified”Thiscategorycont

31、ainstwogroups:SNPsthatJSNPcertifiesarelikelytoberealbasedonmanualinspectionoftheirdata(buthavenotbeengenotyped)，andSNPsthatPerlegenverifiedindependently.Category4bac-overlapTheseareSNPsfromBACoverlapsthatdonotfallintocategory1or2above基因芯片與SNP分析基因芯片技術(shù)作為一種新興的生物技術(shù)，近年來得到迅速發(fā)展，其應(yīng)用具有巨大的潛力。單核苷酸多態(tài)性（SNP）作為新的遺

32、傳標(biāo)記對(duì)基因定位及相關(guān)疾病研究的意義亦非常重大。本文主要介紹了DNA芯片技術(shù)的原理和分類、單核苷酸多態(tài)性檢測方法及DNA芯片技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性檢測方面的應(yīng)用。生物芯片技術(shù)是90年代初發(fā)展起來的，集分子生物學(xué)、微電子技術(shù)、高分子化學(xué)合成技術(shù)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等于一身的一門新型技術(shù)。目前發(fā)展的生物芯片種類繁多，如蛋白質(zhì)芯片、基因芯片、激素芯片、藥物芯片等。但最初的生物芯片主要用于對(duì)DNA的測序，基因表達(dá)譜的鑒定及基因突變體的檢測、分析等方面。迄今為止，使用最多的也是DNA芯片。DNA水平遺傳多態(tài)性標(biāo)記至今已經(jīng)歷了3個(gè)階段:限制性酶切片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RFLP）、DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記（包括小衛(wèi)星

33、、微衛(wèi)星DNA重復(fù)序列）、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）。SNP具有數(shù)量多，分布廣泛，易于快速、規(guī)模化篩查，便于基因分型等特點(diǎn)。伴隨著SNP檢測和分析技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，尤其是與DNA芯片等技術(shù)的結(jié)合，SNPs在基因定位中具有巨大優(yōu)勢和潛力，并為dn芯片應(yīng)用于遺傳作圖提供了基礎(chǔ)。由于基因芯片具有攜帶信息量大和檢測方便的特點(diǎn)，使得用DNA芯片對(duì)SNP進(jìn)行分析具有廣闊的前景。DNA芯片和SNP分析已日益成為研究功能基因組學(xué)的工具。1、基因芯片基因芯片的基本原理是應(yīng)用已知的核苷酸序列作為探針與標(biāo)記的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，通過對(duì)信號(hào)的檢測進(jìn)行定

34、性與定量分析?；蛐酒稍谝晃⑿〉幕ü杵?、玻片等）表面集成大量的分子識(shí)別探針，能夠在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量基因，進(jìn)行大信息量的檢測分析?；蛐酒瑧?yīng)用很廣，根據(jù)所用探針類型不同分為cDNA微陣列（或cDNA微陣列芯片）和寡核苷酸陣列（或芯片），根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同而制備的專用芯片如毒理學(xué)芯片（toxchip）、病毒檢測芯片（如肝炎病毒檢測芯片）、p53基因檢測芯片等。根據(jù)其作用可分為檢測基因質(zhì)和量的芯片。量的檢測包括:檢測mRNA水平、病原體的有無及比較基因組基因的拷貝數(shù)，既可用寡核苷酸芯片，又可用cDNA芯片完成，但cDNA芯片更具優(yōu)勢。質(zhì)的檢測包括:DNA測序及再測序、基因突變和SNP檢測等

35、，主要用寡核苷酸芯片完成。巢式PCR-RFLP技術(shù)巢式PCR-RFLP是針對(duì)任意的基因分型技術(shù)，使任何位點(diǎn)最終都能進(jìn)行常規(guī)限制性內(nèi)切酶鑒定；同時(shí)該SNP分型技術(shù)利用巢式PCR技術(shù)，使得多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行分析成為可能。即使低濃度的DNA也能夠進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分型工作。與現(xiàn)有常規(guī)的分型技術(shù)相比，其最大的優(yōu)勢包括：（一）所需DNA濃度低。l-2ng/uL也能完成檢測工作，而Taqman技術(shù)所需的DNA含量至少5ng/uL。（二）價(jià)格低。由于不需要合成熒光探針，使得該技術(shù)比Taqman技術(shù)價(jià)格低，該優(yōu)勢在對(duì)多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行分型時(shí)更明顯。技術(shù)基本原理和實(shí)例采用的巢式PCR-RFLP分型技術(shù)，其基本原來是利用

36、PCR引物的3,端，對(duì)SNP位點(diǎn)附近的堿基進(jìn)行人為改造，產(chǎn)生一個(gè)常規(guī)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，如SNPrsl321425（rsl321425來自NCBI的refSNP數(shù)據(jù)庫）的C/G,其任何一個(gè)堿基和上下游堿基無法形成一個(gè)可直接被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列，于是我們對(duì)SNP位點(diǎn)前的上游堿基進(jìn)行改造，通過對(duì)序列的分析和PCR效果的計(jì)算，我們將原本四個(gè)堿基AGAT改成CTGC，結(jié)合后一個(gè)堿基A以及SNP位點(diǎn)G,形成CTGCAG（PstI）酶切識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)測序和序列對(duì)比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642,成功的將2個(gè)堿基，3個(gè)堿基進(jìn)行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAA

37、TAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATAC/GACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCACTTCTGTAAACTACATGCACTAAT與Taqman技術(shù)和普通技術(shù)的詳細(xì)對(duì)比分型技術(shù)PCR-RFLP技術(shù)Taqman技術(shù)普通PCR-RFLP技術(shù)最佳運(yùn)用時(shí)機(jī)200-600樣本，任何DNA多態(tài)位點(diǎn)樣本量大于500人份僅適合含有現(xiàn)成酶切位點(diǎn)的多態(tài)位點(diǎn)的分型試劑投入低熒光探針，需3000-4000元。有可能實(shí)驗(yàn)失敗需重新花錢設(shè)計(jì)熒光探針。低技術(shù)的適用性可適合任何多態(tài)位點(diǎn)的分型基本適合任何多態(tài)位點(diǎn)的分型，但有時(shí)若干位點(diǎn)不能成功進(jìn)行試驗(yàn)；當(dāng)分型位點(diǎn)過于接近也不能用該方法。僅適合含有現(xiàn)

38、成酶切位點(diǎn)的多態(tài)位點(diǎn)的分型，有時(shí)出現(xiàn)的是一些稀有酶的酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致效率低下或費(fèi)用昂貴；結(jié)果判斷直觀，明確，穩(wěn)定間接，每管反應(yīng)必須加熒光參照ROX，否則結(jié)果判斷不確定一般直觀，明確；有時(shí)酶切位點(diǎn)出現(xiàn)在非主頻等位基因上，導(dǎo)致結(jié)果判讀困難結(jié)果穩(wěn)定性穩(wěn)定一般穩(wěn)定結(jié)果準(zhǔn)確性準(zhǔn)確度高一般準(zhǔn)確度高樣本消耗量1-2ng5-10ng50100ng實(shí)驗(yàn)耗時(shí)2-3周由于要定制MGB熒光探針，和預(yù)實(shí)驗(yàn)，也需要2-3周2-3周操作流程1基本信息收集具體內(nèi)容包括客戶信息、樣本數(shù)case,control）數(shù)、位點(diǎn)信息等。2位點(diǎn)信息的查詢主要包括：2.1位點(diǎn)上下游各300bp的確切序列，基因頻度;2.2有無文獻(xiàn)報(bào)道證明該位點(diǎn)

39、多態(tài)存在于中國人群;2.3如無上述相關(guān)文獻(xiàn)，在J-SNP數(shù)據(jù)庫中查詢?cè)撐稽c(diǎn)多態(tài)是否存在于東亞人群中。為了保證結(jié)果的可靠，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)原則上應(yīng)以野生型進(jìn)行酶切鑒定，因此確認(rèn)snp的頻度是非常重要的。3樣品質(zhì)控從全部樣品中取8%樣品，即96個(gè)樣品中取8個(gè)樣品，用我們的一對(duì)特異的PCR引物進(jìn)行樣品質(zhì)控，以檢測送來樣品是否良好。因?yàn)榭蛻魳悠焚|(zhì)量是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一，只有客戶提供的樣品質(zhì)量可靠穩(wěn)定，那么結(jié)果自然就好。4引物設(shè)計(jì)同時(shí)設(shè)計(jì)AB兩套方案，分別以正鏈和負(fù)鏈為模板設(shè)計(jì)引物。5單管測試進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案可行性嘗試，首先要在多種溫度，多種Mg離子、多種添加劑加入的情況下進(jìn)行方案的可行性測試，對(duì)于所有單管

40、測試的結(jié)果都送去測序，以保證序列的正確性，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到確認(rèn)的基礎(chǔ)上，挑選穩(wěn)定的方案進(jìn)入中試過程。6中試抽取8個(gè)樣品做小規(guī)模批量實(shí)驗(yàn)，以模擬和檢查批量PCR情況和酶切情況。7.大規(guī)模實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備將DNA模板按方案進(jìn)行一次性分板（有冗余），并引入陽性和陰性對(duì)照，同時(shí)將所有相關(guān)的PCR體系進(jìn)行一次性大規(guī)模分裝，防止污染。8.第一板數(shù)據(jù)先用一板模板進(jìn)行一輪PCR和酶切，以檢驗(yàn)體系和分板的情況。9正式實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)要點(diǎn)1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必需保證野生型的被限制性內(nèi)切酶切開因?yàn)閷?duì)于只有少量突變型的SNP位點(diǎn)，如果突變型被切開，那么所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就是大量沒有被酶切開的PCR產(chǎn)物，而這個(gè)結(jié)果與酶切實(shí)驗(yàn)失敗的結(jié)果非常類似，

41、不易區(qū)分，對(duì)結(jié)果的判讀造成很大的麻煩，因此保證了主頻堿基被解開，從根本上保證了實(shí)驗(yàn)的可靠性。偏向性擴(kuò)增的解決。所謂偏向性擴(kuò)增是因?yàn)镾NP位點(diǎn)上會(huì)往往存在嘌吟和嘧啶的替換，在PCR過程中，聚合反應(yīng)對(duì)嘧啶（C或T）比較敏感，使得嘌吟（A或T）的擴(kuò)增非常少，而出現(xiàn)偏向性擴(kuò)增，這在SNP位點(diǎn)附近嘌吟含量較高時(shí)特別明顯。為此，本公司專門設(shè)計(jì)一個(gè)方案，用以克服偏向性擴(kuò)增。3方案設(shè)計(jì)中的內(nèi)切酶的選擇雖然從理論上，我們的方案可以進(jìn)行任意位點(diǎn)改造，但事實(shí)上在改造過程中會(huì)出現(xiàn)一系列的問題，包括擴(kuò)增效率，堿基劃移等一系列問題，使得改造方案失敗。對(duì)此，我們公司專業(yè)開發(fā)了一個(gè)引物設(shè)計(jì)軟件，通過運(yùn)算獲得最佳的改造方案，同

42、時(shí)通過在正向和反向序列上同時(shí)設(shè)計(jì)方案，以保證試驗(yàn)的成功。4PCR產(chǎn)物的污染問題在大規(guī)模的PCR過程中，最嚴(yán)重的問題是PCR產(chǎn)物污染，據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)總結(jié),80%以上的污染是由于接觸式污染，剩余的污染則包括氣溶膠污染等環(huán)境造成的污染。對(duì)于PCR污染這個(gè)問題，本公司制訂了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)措施，具體包括使用濾芯搶頭、所有PCR體系全部分裝、PCR體系與各類模板嚴(yán)格分離、配置體系人員與接觸PCR產(chǎn)物人員嚴(yán)格分離等一系列措施，同時(shí)在處理PCR管,eppendorf管時(shí)也規(guī)定了詳細(xì)的操作過程。5.關(guān)于質(zhì)量控制問題在每板空過程中，我們會(huì)放入兩個(gè)陰性對(duì)照和一個(gè)重復(fù)對(duì)照，以確認(rèn)PCR的過程中不會(huì)產(chǎn)生污染和PCR的結(jié)果確實(shí)可

43、信。RFLP技術(shù)一、材料基因組DNA（大于50kb，分別來自不同的材料）。二、設(shè)備電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板（比膠塊略大）4塊，吸水紙若干，尼龍膜（依膠大小而定），濾紙，eppendorf管（0.5ml）若干。三、試劑：1、限制性內(nèi)切酶（BamHI,EcoRI,Hindlll,XbaI）及10 x酶切緩沖液。2、5xTBE電泳緩沖液：配方見第一章。3、變性液：0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl。4、中和液：lmol/LTrisCl,pH7.5/1.5mol/LNaClo5、10 xSSC:配方見第九章。6、其它試劑：0.4mol/LNaOH,0.2mol/L

44、TrisCl,pH7.5/2xSSC,ddH2O,Agarose0.8%,0.25mol/LHClo操作步驟基因組DNA的酶解大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)，要求提取的DNA分子量大于50kb,沒有降解。在50卩1反應(yīng)體系中，進(jìn)行酶切反應(yīng)：5yg基因組DNA5卩110 x酶切緩沖液20單位(U)限制酶(任意一種)加ddH2O,至50卩1輕微振蕩，離心,37C反應(yīng)過夜。取5卩1反應(yīng)液,0.8%瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時(shí)不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。注意未酶切的DNA要防止發(fā)生降解，酶切反應(yīng)一定要徹底。Southern轉(zhuǎn)移(1)酶解的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳(可18V過

45、夜)后EB染色觀察。將凝膠塊浸沒于0.25mol/LHC1中脫嘌吟，10分鐘。取出膠塊,蒸餾水漂洗,轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。預(yù)先將尼龍膜，濾紙浸入水中,再浸入10XSSC中，將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置，蓋上尼龍膜，上覆二層濾紙，再加蓋吸水紙，壓上半公斤重物，以10XSSC鹽溶液吸印，維持18-24小時(shí)。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。(5)取下尼龍膜，0.4mol/LNaOH30秒，迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/LTrisCl,pH7.5/2xSSC,溶液中，5分鐘。(6)將膜夾于2層濾紙內(nèi)，80C真空干燥2小時(shí)。(7)探針的制備和雜交見第九章分

46、子雜交部分。注意1、步驟(2)中脫嘌吟時(shí)間不能過長。2、除步驟(1)、(4)、(5)外，其余均在搖床上進(jìn)行操作。3、步驟(4)中，當(dāng)尼龍膜覆于膠上時(shí)，絕對(duì)防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生，加蓋濾時(shí)也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。4、有時(shí)用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時(shí)應(yīng)該試用另一種酶PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。一.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及活性PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除

47、凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值

48、，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或10

49、0ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。1假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的

50、靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，

51、但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。2出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或

52、采用二溫度點(diǎn)法（93C變性，65C左右退火與延伸）。3出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。二.PCR污染與對(duì)策PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因（一）標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交

53、叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。（二）PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml）,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)

54、及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是獲得適當(dāng)?shù)目贵w-DNA復(fù)合物。用鏈親和素將生物素標(biāo)記的抗體與生物素標(biāo)記的DNA偶

55、聯(lián)的方法，因每個(gè)鏈親和素分子可與四個(gè)生物素分子結(jié)合，因此要優(yōu)化反應(yīng)條件，以使得每個(gè)鏈親和素分子既能結(jié)合上抗體分子，又能結(jié)合上DNA。此外，還可用化學(xué)方法將DNA與抗體分子共價(jià)偶聯(lián)，即將抗體分子和5端氨基酸修飾的DNA分別用不同的雙功能偶聯(lián)劑激活,然后通過自發(fā)的反應(yīng)偶聯(lián)到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetylthioacetate(SATA)活化氨基修飾的DNA，用Sulfo-Succinimidyl4-(maleimidomethyl)Cyclohexane-l-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修飾抗體分子，然后將二者在一小管中混合，通過加入鹽酸胲(Hydr

56、oxylaminehydrochloride)使二者偶聯(lián)在一起。免疫PCR具有高敏感性。因此，抗體和標(biāo)記DNA的任何非特異性結(jié)合均可導(dǎo)致嚴(yán)重的本底問題。因而在加入抗體和標(biāo)記DNA后必須盡可能徹底地清洗。即使有些特異性結(jié)合的抗體或標(biāo)記DNA被洗掉了，亦可在最后通過增加PCR的循環(huán)次數(shù)得到彌補(bǔ)。此外，應(yīng)用有效的封閉劑對(duì)防止非特異性結(jié)合也是非常重要的?？捎妹撝谭酆团Ｑ灏椎鞍鬃龅鞍追忾]劑，用魚精DNA做核酸封閉劑。防止本底信號(hào)的另一個(gè)重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測系統(tǒng)存在的問題。即使每一步試驗(yàn)都做得非常認(rèn)真，重復(fù)使用同樣的引物和標(biāo)記DNA均會(huì)產(chǎn)生假陽性信號(hào)。免疫PCR的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記DN

57、A序列完全是人為選定。因此標(biāo)記DNA及其引物可經(jīng)常變換，以避免由于污染造成的假陽性信號(hào)。免疫PCR可以檢測到常規(guī)免疫學(xué)方法無法檢測的樣品。因此,應(yīng)用免疫PCR可在微觀水平(單細(xì)胞)檢測抗原，定量PCR產(chǎn)物可以估計(jì)某一標(biāo)本中的抗原數(shù)量，在臨床診斷中可在疾病早期抗原量很低時(shí)檢測到微量的抗原。(1)免疫PCR的優(yōu)化策略一一新型連接分子的出現(xiàn)葉綠素分子和鏈酶卵白素喬生軍等用自然界普遍存在的葉綠素分子(chlorophy)作為共價(jià)連接蛋白與核酸的中間分子，構(gòu)建了甲胎蛋白(AFP)抗體的基因探針，此探針人為地把抗體直接錨定在雙鏈DNA分子上，復(fù)合分子性質(zhì)均一穩(wěn)定，室溫至少保存6個(gè)月，大大簡化了中間步驟，降

58、低了成本，使免疫PCR更易推廣。也有人用鏈酶卵白素將生物素化的抗體與生物素化的DNA分子直接連接，也得了良好的較果。雙特異融合蛋白任軍將編碼單鏈抗體和鏈親和素融合蛋白的基因插入載體在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得了具備結(jié)合生物素和抗原分子的雙特異性融合蛋白，可直接連接抗體和生物素化的DNA分子。該融合蛋白可利用工程菌大量制備，性質(zhì)優(yōu)良，價(jià)格低廉。生物素化F(abJ2段代替生物素化單抗抗體的Fab或F(abz)2易于標(biāo)記，且因缺乏Fc段大大降低了非特異性吸附的可能性，使免疫PCR的本底大為降低。Yashito用胃蛋白酶消化單抗，把得到的Fab段用生物素標(biāo)記，以此來檢測ANP,使其特異性大為提高。(2)

59、免疫-PCR的改進(jìn)雖然Sano等人構(gòu)建的免疫-PCR具有極高的靈敏度，但Sano所用的連接分子鏈親和素-蛋白A嵌合體還沒有商品化，因此限制了它在實(shí)際應(yīng)用中的廣泛普及。Ruzicka等人以生物素化的抗體取代Sano免疫-PCR系統(tǒng)中的抗體，用商品化的親和素代替鏈親和素-蛋白A嵌合體作為連接分子構(gòu)建了一個(gè)新的免疫-PCR系統(tǒng)。Ruzicka用此免疫-PCR系統(tǒng)檢測小鼠抗載脂蛋白E抗體?？梢詸z測出包被濃度為10fg/ml的E抗體。此外,Sano的免疫-PCR實(shí)驗(yàn)流程需要眾多的洗滌步驟，使實(shí)驗(yàn)過程相當(dāng)繁瑣，并需要大量的操作時(shí)間。Zhou等人對(duì)此作了改進(jìn)，他們用生物素化的二抗和游離鏈親和素作為連接分子進(jìn)

60、行免疫-PCR實(shí)驗(yàn),把每個(gè)步驟的洗滌次數(shù)從原先的715次減至35次，從而減少了操作時(shí)間，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，用修飾過的抗原稀釋緩沖液（modifiedantigendilutionbuffer,MADB）代替Sano免疫-PCR中的TBS作為抗原稀釋液，它主要把TBS中胍的濃度調(diào)到2M,由此解決了抗原的溶解問題。Zhou檢測了人原癌基因ETSI,檢測濃度可達(dá)到96X10-15M,是常規(guī)ELISA的105倍。與Sano的免疫-PCR系統(tǒng)相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的試劑，生物素和親和素（鏈親和素）都已經(jīng)商品化，因此在實(shí)際操作中得到廣泛應(yīng)用。但直接包被待檢抗原不