1、實驗五 平板菌落計數(shù)法 1實驗原理 平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。 2優(yōu)缺點能分辨活菌由于待測樣品往往不宜完全分散成單個細胞，所以，長成一個單菌落也可能來自樣品中的23或更多個細胞。因此，平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。時間長，繁瑣。 3四、操作步驟1編號 取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6 (稀釋度)各3套，另取6支盛有4.5m1無菌水的試管，依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10

2、-6。42稀釋 取0.5mL已充分混勻的大腸桿菌菌懸液(待測樣品)，至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。 將10-1 試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。用1mL吸管插入10-1 試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底。吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1 菌液0.5mL，放至10-2試管中，此即為100倍稀釋。其余依次類推，整個過程如下頁圖所示。 563、取樣 用三支1mL無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各1mL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2m1 一、

3、混合法74倒平板 盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45左右的培養(yǎng)基約15mL平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并已冷卻至45左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。85計數(shù) 培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進行計算： 每毫升中菌落形成單位(Cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)*5一般選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同稀釋度的

4、三個重復對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。9二、涂布法先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒板，待凝固后編號，并于37左右的溫箱中烘烤30min，或在超凈工作臺上適當吹干，然后無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上2030 min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置在37的恒溫箱中培養(yǎng)2448h。涂布平板用的菌懸液量一般以0.1mL較為適宜，如果過少，菌

5、液不易涂布開；過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。101結(jié)果將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填人下表：112思考題為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45左右才能倒平板?要使平板菌落計數(shù)準確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵?為什么?試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點及應(yīng)用。當平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?用倒平板法和涂布法計數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間（48h）后觀察結(jié)果？12革蘭氏染色法13一、目的要求學習并初步掌握革蘭氏染色法。了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。14革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染

6、劑結(jié)晶紫進行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙醇）脫色，最后用復染劑（如蕃紅）復染。經(jīng)此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色（紅色），該菌屬于革蘭氏陰性菌。15原理 革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫一碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖

7、層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結(jié)晶紫一碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。 16三、實驗器材菌種：大腸桿菌約24h培養(yǎng)物蠟樣芽孢桿菌1220h培養(yǎng)物。171制片取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱(以玻片不燙手為宜)。182初染滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色12min，水洗。193媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。204脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性苗，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌脫色時間一般約2030S。215復染 用番紅液復染約2min，水洗。6鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成藍紫