1、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 Technology for Cell Biology學(xué)習(xí)目的與要求掌握細(xì)胞生物學(xué)基本研究方法的原理和應(yīng)用。熟悉細(xì)胞生物學(xué)基本研究方法的技術(shù)特點。了解細(xì)胞生物學(xué)研究方法的進(jìn)展。第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法Technology for Cell Biology第一節(jié)第二節(jié)第三節(jié)中英文退 出第四節(jié)第五節(jié)第六節(jié)第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)三、納米顯微技術(shù)四、超分辨光學(xué)顯微技術(shù)退 出首 頁Technology for Cell Biology第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)普通光學(xué)顯微鏡的分辨率1.分辨率（resolution，R） 顯微鏡或人眼在2

2、5cm的明視距離處，能分辨 被檢物體微細(xì)結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)Cell,2010(143):1047-1058退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)普通光學(xué)顯微鏡的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)不同顯微結(jié)構(gòu)的尺寸由左至右依次為動物細(xì)胞、細(xì)菌、線粒體、流感病毒、核糖體、綠色熒光蛋白、胸腺嘧啶。虛線為光學(xué)顯微鏡分辨極限。Cell,2010(143):1047-1058退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法2.分辨率公式n = 聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射 率，空氣為1，油為1.

3、5。= 標(biāo)本對物鏡鏡口張角的半角， sin的最大值為1。= 照明光源的波長，白光0.5 m 。橫向分辨率 Rx,y=0.61/nsin 縱向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)普通光學(xué)顯微鏡的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)3.組織切片制備過程 固定（fixation） 使大分子交聯(lián)而保持在原有的位置上，防止結(jié)構(gòu)移位或信息丟失。 常用的固定劑：戊二醛、甲醛 包埋（embedding） 使組織形 成硬塊，便于切片。 常用的包埋劑：石蠟、樹脂戊二醛甲醛退 出Technology for Cell Biology

4、首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)普通光學(xué)顯微鏡的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)3.組織切片制備過程 切片（section） 切片厚度為110m。 染色（staining） 增大反差。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)普通光學(xué)顯微鏡的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)組織切片制備過程退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法宮頸鱗癌組織切片退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)熒光顯微鏡可以呈現(xiàn)強(qiáng)反差的彩色圖像1.熒光和熒光染料 熒光

5、熒光分子可以在吸收特定波長的光后，發(fā)射出更長波長的可見光，稱為熒光。前者稱為激發(fā)光 (excitation light)，后者稱為發(fā)射光(emission light)。 熒光染料由于熒光分子可以使被檢樣品呈現(xiàn)不同的染色，因此也稱熒光染料。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)常見熒光分子的激發(fā)光與發(fā)射光波長范圍退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光素(fluorescein)，綠色熒光四甲基羅丹明(tetramethyrhodanmine)，紅色熒光退 出Tech

6、nology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)熒光顯微鏡可以呈現(xiàn)強(qiáng)反差的彩色圖像2.熒光顯微鏡工作原理熒光顯微鏡（fluorescence microscope）的結(jié)構(gòu)特點： 以高壓汞燈和弧光作為光源。兩組濾光片。熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(二)熒光顯微鏡可以呈現(xiàn)強(qiáng)反差的彩色圖像3.應(yīng)用成像反差強(qiáng)，檢測靈敏度高。 定性、定位和定量的研究組織內(nèi)的熒光標(biāo)記物質(zhì)。對活細(xì)胞內(nèi)分子的動態(tài)變化進(jìn)行實時觀察。 退 出Technology for Cell Biolog

7、y首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(三)相差顯微鏡通常被用于觀察活細(xì)胞波長變化振幅變化光速變化顏色變化明暗變化相位變化人眼能感知人眼不能感知原理：退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡（phase contrast microscope）：利用光的衍射和干涉效應(yīng)把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差變成振幅差，使活細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比。(三)相差顯微鏡通常被用于觀察活細(xì)胞應(yīng)用：活細(xì)胞觀察退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、

8、光學(xué)顯微鏡技術(shù)相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的HeLa細(xì)胞退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法相差顯微鏡下觀察到的懸浮生長的昆蟲草地夜蛾卵巢Sf9細(xì)胞退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法原理：散射光成像。應(yīng)用：分辨率不高。適合觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和真菌等。 (四)暗視野顯微鏡通過散射光成像暗視野顯微鏡工作原理退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(五)顯微電影攝影技術(shù)記錄細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動過程 原

9、理：用顯微電影攝影術(shù)或電視錄像以一定時間間隔拍攝。應(yīng)用：準(zhǔn)確記錄細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動過程和速度。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(六)共聚焦激光掃描顯微鏡可以提供高清晰的彩色 三維圖像原理：單色激光作為光源。共聚焦：物鏡和聚光鏡互相共焦點，只有從標(biāo)本焦面發(fā)出的光線聚焦成像，焦面以外的漫射光不參加成像。逐點掃描。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(六)共聚焦激光掃描顯微鏡可以提供高清晰的彩色 三維圖像應(yīng)用：進(jìn)行連續(xù)的光學(xué)切片，通過電腦進(jìn)行 三維

10、重建。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)共聚焦激光顯微鏡工作原理示意圖退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法共聚焦激光顯微鏡下的血管內(nèi)皮細(xì)胞微絲的分布退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法共聚焦激光顯微鏡獲得被檢物體三維結(jié)構(gòu)的原理及呈現(xiàn)的三維圖像退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法以電子束作光源，波長短，分辨率高。 電子顯微鏡分辨率 理論值：0.002nm

11、實際值：0.1nm 生物樣品：2nm 電鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)稱為超微結(jié)構(gòu)。二、電子顯微鏡技術(shù)退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM ）光學(xué)顯微鏡與透射電子顯微鏡的比較退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)透射電子顯微鏡標(biāo)本制備過程： 固定：雙重固定鋨酸固定脂類，戊二醛固定蛋白。 脫水：含水標(biāo)本干擾觀察。 包埋：環(huán)氧樹脂是常用包埋劑。(一)透射電子顯微鏡退 出Technology f

12、or Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)透射電子顯微鏡標(biāo)本制備過程 切片：電子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度通常為50100nm。 染色：生物分子散射電子能力弱，需通過重金屬染色，增大反差，常用鋨、鈾、鉛等重金屬的鹽類。 (一)透射電子顯微鏡退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)(二)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope， SEM）原理：通過電子束照射在標(biāo)本后產(chǎn)生的二次電子成像，二次電 子產(chǎn)生的多少與電子束在標(biāo)本表面的投射角有關(guān)。 應(yīng)用：可以直

13、接觀察標(biāo)本表面的三維形態(tài)?？茖W(xué)Scientific American 中文版退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)(二)掃描電子顯微鏡科學(xué)Scientific American 中文版退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)掃描電鏡的工作原理 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡觀察的有絲分裂中期染色體形態(tài)（中國醫(yī)科大學(xué)宋今丹提供）退 出Technology for Cell Biology

14、首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法凋亡細(xì)胞及凋亡小體透射電鏡照片(左)和掃描電鏡照片(右)，顯示凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，凋亡小體正從細(xì)胞脫落。（中國醫(yī)科大學(xué)宋今丹提供）退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(三)透射電子顯微鏡借助金屬投影、冰凍斷裂及冰凍蝕刻技術(shù)可獲取三維圖像1.金屬投影法（metal shadowing） 原理：以一定的傾斜角度向樣品表面噴重金屬，顯示 投影效果，給出樣品表面三維結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用：觀察蛋白、核酸類大分子，病毒顆粒及細(xì)胞壁 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二

15、、電子顯微鏡技術(shù)2.冰凍斷裂（freeze-fracture） 樣品快速冷凍 冰刀從脂雙層疏水部分撬開 暴露膜內(nèi)部構(gòu)造 樣品制備：應(yīng)用：觀察細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的內(nèi)部構(gòu)造。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)2.冰凍斷裂（freeze-fracture） 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)葉綠體內(nèi)膜冰凍斷裂復(fù)形，顯示內(nèi)膜上存在大量膜蛋白退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法3.冰凍蝕刻（freeze

16、-etch）冷凍組織 冰刀撬組織 真空中升華 暴露膜結(jié)構(gòu) 應(yīng)用：觀察細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造。 樣品制備：退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)3.冰凍蝕刻（freeze-etch）退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)冰凍蝕刻顯示昆蟲肌肉細(xì)胞中的蛋白纖維退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù)納米尺度：1nm100nm 生命是納米尺度的分子活動，細(xì)胞是納米組裝機(jī)的集合體。 掃描隧道顯微鏡和原

17、子力顯微鏡的分辨率和可操控的顆粒在納米水平，被稱作納米顯微技術(shù)。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù)退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法1.掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope,STM）原理：使用原子尺度的探針在標(biāo)本的表面進(jìn)行掃描，在探針 針尖和樣品間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本表面形貌變 化的隧道電流。特點：分辨率高，可在大氣和液體等非真空狀態(tài)下工作。 應(yīng)用：直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)，如DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 。退 出Technolog

18、y for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù)1.掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope,STM）掃描隧道顯微鏡下的人紅細(xì)胞血影退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù)2.原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）原理：通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所 觀察表面的微觀信息。 特點：可以在三態(tài)（固態(tài)、氣態(tài)和液態(tài)） 狀況下工作。應(yīng)用：活細(xì)胞表面及生物大分子空間伸展及其結(jié)晶體表面觀測 進(jìn)行單個分子操作。退 出Te

19、chnology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù)2.原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）針尖的曲率半徑通常為5-10nm退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù) 原子力顯微鏡下的中國倉鼠卵巢細(xì)胞 原子力顯微鏡下的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法原子力顯微鏡觀察細(xì)胞膜表面，顯示兩種分子大小不同的膜脂參與了此細(xì)胞膜的組成。原子力顯微鏡測定大分子間的作用力。

20、左圖中DNA分子固定在支持物上，原子力顯微鏡的探針吸附了與DNA分子結(jié)合的蛋白。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、超分辨光學(xué)顯微技術(shù)由光的衍射效應(yīng)導(dǎo)致的光學(xué)顯微鏡分辨率極限稱 為Abbe限度(Abbe limit)。應(yīng)用新的光學(xué)原理、發(fā)光/示蹤分子和信號分析 技術(shù)，建立起了能夠突破Abbe限度的超分辨顯 微技術(shù)，使光學(xué)顯微鏡的分辨率達(dá)到了3050nm 的納米尺度。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、超分辨光學(xué)顯微技術(shù)光的衍射效應(yīng)使物鏡的焦點呈橢圓形(左)；當(dāng)兩點間的距離大

21、于衍射限度時，物鏡能夠呈現(xiàn)兩個像，如兩根微管的橫切面A；當(dāng)兩點間的距離小于衍射限度時，物鏡不能夠呈現(xiàn)兩個像，如兩根微管的橫切面B。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法STED顯微技術(shù)成像與共焦顯微技術(shù)成像比較以線粒體膜蛋白TOM20為標(biāo)志蛋白，左上為共焦顯微鏡呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)，右上為STED顯微鏡呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)。左下為TOM2和線粒體基質(zhì)蛋白HSP70在共焦顯微鏡下呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)。右下為由STED技術(shù)重建的線粒體三維結(jié)構(gòu)。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法SIM顯微技術(shù)成像與共

22、焦顯微技術(shù)成像比較將核孔復(fù)合體標(biāo)記成紅色，核纖層蛋白B標(biāo)記成綠色、DNA標(biāo)記成藍(lán)紫色，用共焦顯微鏡呈現(xiàn)的細(xì)胞核中間位置橫切面結(jié)構(gòu)，小圖為方框內(nèi)的細(xì)微結(jié)構(gòu)(上)；相同方法標(biāo)記細(xì)胞核，SIM技術(shù)三維重建后呈現(xiàn)的細(xì)胞核中間位置橫切面結(jié)構(gòu)。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法第二節(jié) 細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 一、細(xì)胞分離二、細(xì)胞培養(yǎng)離心方法 流式細(xì)胞術(shù) 免疫磁珠法 激光捕獲顯微切割技術(shù) 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法從組織中分離細(xì)胞的第一步是將組織制備成游離的細(xì)胞懸液。 一、不同類型細(xì)胞的分離

23、胰蛋白酶、膠原酶EDTA消除細(xì)胞間的連接和細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞分離需根據(jù)不同細(xì)胞的特征采用不同的方法。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離(一)離心方法 利用細(xì)胞的密度特性可有效分離不同的細(xì)胞。如血漿白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法流式細(xì)胞儀（flow cytometer）：從多細(xì)胞懸 液中分離目的細(xì)胞的精密儀器。 樣品處理：用帶有熒光的特異抗體標(biāo)記待分離 的細(xì)胞。分離速度：2萬個細(xì)胞/s 。 分離純度：95% 。(二)流式細(xì)胞術(shù)退 出

24、Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離(二)流式細(xì)胞術(shù)Beckman FC500 流式細(xì)胞儀外形流式細(xì)胞儀工作原理退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離Beckman FC500 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(三)免疫磁珠法 利用帶有特定單抗的免疫磁珠（immunomagnetic microsphere）與靶細(xì)胞的特異結(jié)合，快速地從多細(xì)胞懸液中將目的細(xì)胞分離出來。 退

25、 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離(三)免疫磁珠法 分離純度：9599 Fe2O3或Fe3O4顆粒 + 單克隆抗體 免疫磁珠退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離(四)激光俘獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection，LCM）原理：在載玻片上制作冰凍或石蠟切片并染色，通過直接的 顯微鏡觀察，用能量較低的紅外激光切割而獲得所需要的組織細(xì)胞，甚至單個細(xì)胞。應(yīng)用：從組織切片中精確地分離一個單一的細(xì)胞 退 出Techn

26、ology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離(四)激光俘獲顯微切割技術(shù)退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 二、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)：從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存、生長和增殖的一種方法。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 二、細(xì)胞培養(yǎng)1.條件 營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：

27、RPMI-1640、DMEM。 血清。 5%CO2 無菌環(huán)境退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱相差顯微鏡超凈工作臺退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法2.原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primary culture）：直接取材于有機(jī) 體組織的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)（secondary culture）：原代培養(yǎng)的細(xì) 胞從培養(yǎng)瓶中取出，以1:2以上的比例的擴(kuò) 大培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞通常表現(xiàn)出其來源 組織的分化特征。退 出Technology for

28、 Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 二、細(xì)胞培養(yǎng)3.細(xì)胞系細(xì)胞系（cell line）：在培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生“不死”的 變異細(xì)胞，這種細(xì)胞可以無限繁殖、傳代。細(xì)胞系的來源包括培養(yǎng)過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞和取材于腫瘤組織的原代培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞株（cell strain）：用細(xì)胞克隆化的方法進(jìn)一步改 善細(xì)胞系的均一性，即分離出單個細(xì)胞使之增殖 形成的細(xì)胞群。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 二、細(xì)胞培養(yǎng)第三節(jié) 細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù)一、細(xì)胞裂解二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級離心三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定四、核酸的分離純化與鑒

29、定退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、細(xì)胞裂解在細(xì)胞組分的分級離心前，首先破碎細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿液。方法： 低滲透壓； 超聲振蕩； 強(qiáng)制通過微孔； 機(jī)械破碎及研磨； 去垢劑：如SDS、TritonX-100、NP-40 常用于蛋白質(zhì)的抽提； 離液劑：如鹽酸胍、尿素 常用于細(xì)胞DNA和RNA的抽提。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級離心 (一)差速離心（differential centrifugation）方法：從高速到低速逐級沉降。分離對象：體積、

30、質(zhì)量差別較大 的顆粒 。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)速度沉降（velocity sedimentation）方法：在離心管中制備由頂部到底部逐漸增加 的蔗糖溶液密度梯度(通常5%20%)。分離對象：沉降系數(shù)不同的顆粒。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級離心 (三)平衡沉降（equilibrium sedimentation） 方法：在離心管中制備由頂部到底部高濃度差的 蔗糖或氯化銫溶液密度梯度。 分離對象：密度不同顆粒。退 出Technol

31、ogy for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級離心 速度沉降(A)和平衡沉降(B)離心的比較 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級離心 (四)非細(xì)胞體系 (cell free system) 1. 概念非細(xì)胞體系是指從分級分離得到的具有生物功能的細(xì)胞抽提物。2. 應(yīng)用將某個生物過程與細(xì)胞中發(fā)生的其他復(fù)雜的反應(yīng)分割開來，從而確定其詳細(xì)的分子機(jī)制，研究各種細(xì)胞器及細(xì)胞成分的功能。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研

32、究方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級離心 三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定(一)柱層析（column chromatography） 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法1.離子交換層析 填充基質(zhì)：離子交換樹脂。 分離原理：電荷不同。2.凝膠過濾層析 填充基質(zhì)：多孔性凝膠顆粒。 分離原理：大小不同。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定(一)柱層析（column chromatography） 3.疏水性層析 填充基質(zhì)：帶有疏水性基團(tuán)的顆粒。 分離原理：疏水性不同。4.親和層析

33、 填充基質(zhì)：結(jié)合有酶底物、特異性抗體或抗原的顆粒。 分離原理：親和性不同。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定(一)柱層析（column chromatography） 三種層析用的基質(zhì) 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)高效液相層析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）填充基質(zhì)：310 m的微小球型樹脂。 特點：分離速度快、分離度高。 退 出Technology for Cell Biology首 頁

34、第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定(二)高效液相層析高效液相分子篩色譜測定純化蛋白的分子量退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定(三) 蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)帶有凈電荷，具有不同形狀、大小以及凈電荷的蛋白質(zhì)分子在電場中會產(chǎn)生不同的遷移速率，進(jìn)而被分離。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定(三) 蛋白質(zhì)電泳1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamid gel electrophoresis ， SDS）支持體：聚丙烯

35、酰胺。樣品處理： SDS還原劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇 分離原理：依據(jù)分子量的不同分離蛋白質(zhì)。 所有蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，呈伸展的多肽鏈 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS） 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法2.等電聚焦（isoelectric focusing）電泳 支持體：丙烯酰胺凝膠。條件：兩性電解質(zhì)在電場當(dāng)中形成pH梯度。分離原理：依據(jù)等電點不同分離蛋白質(zhì)。 退 出Technology for Cell Biology首

36、 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定2.等電聚焦（isoelectric focusing）電泳 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定3.雙向電泳 原理：等電聚焦與SDS結(jié)合 。在長條狀凝膠介質(zhì)中進(jìn)行等電聚焦電泳 。將凝膠條橫放于聚合好的平板SDS-丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行垂直電泳 。應(yīng)用：可一次分離數(shù)千種蛋白。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定四、核酸的分離純化與鑒定(一)差速離心沉淀是核酸分離純化的主要方法 DNA還是RNA

37、，它們在細(xì)胞中總是與蛋白 質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞中。進(jìn) 行核酸分離純化的過程就是使核酸與細(xì)胞內(nèi) 的其他組分分離，去除純化試劑的污染，并 保持核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、核酸的分離純化與鑒定(一)差速離心沉淀是核酸分離純化的主要方法 核酸的高負(fù)電荷磷酸骨架使其比蛋白、脂 類、多糖等細(xì)胞內(nèi)其他組分具有更高的親 水性，可通過選擇性沉淀和差速離心使核 酸與它們分離。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法TRIzol試劑分離RNA和DNA的主要過程

38、組織或細(xì)胞與適量Trizol試劑混合后立即勻漿加入0.2倍Trizol體積的氯仿，振蕩混勻，靜止2min1,2000g，4，離心10min吸取上層無色透明的水相，加入0.75倍TRIzol體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min1,2000g，4，離心10min ，棄上清，獲得RNA沉淀吸取下層紅色的有機(jī)相，加入0.3倍TRIzol體積的無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置3min2000g，4，離心5min ，棄上清，獲得DNA沉淀退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)凝膠電泳是鑒定核酸的主要方法原理：核酸分子中的每個單核苷酸都帶有一個負(fù)電

39、荷，在電場中向陽極移動。 應(yīng)用：分離不同大小的DNA分子。 支持體：瓊脂糖(agarose)與丙烯酰胺。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、核酸的分離純化與鑒定(二)凝膠電泳是鑒定核酸的主要方法瓊脂糖凝膠電泳特點： 操作簡單，電泳速度快，分辨率相對較低。 丙烯酰胺凝膠電泳特點： 分辨率高，操作相對復(fù)雜，多用于500堿基以 下的DNA分子片段的分離。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、核酸的分離純化與鑒定(二)凝膠電泳是鑒定核酸的主要方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果退 出Technol

40、ogy for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、核酸的分離純化與鑒定第四節(jié) 細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù) 一、酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)三、放射自顯影技術(shù) 四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法第四節(jié) 細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù) 形態(tài)與功能相結(jié)合是細(xì)胞生物學(xué)研究的突出特點，顯示細(xì)胞內(nèi)大分子、小分子甚至是無機(jī)離子在細(xì)胞內(nèi)分布的分子示蹤技術(shù)對細(xì)胞生物學(xué)的研究尤為重要。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1.細(xì)胞化

41、學(xué)技術(shù)(cytochemistry technique) 一類將細(xì)胞形態(tài)觀察和組分分析相結(jié)合的分析方法，是在保持組織原有結(jié)構(gòu)的情況下利用生物大分子、小分子、無機(jī)離子的物理、化學(xué)特性來研究它們在細(xì)胞內(nèi)的分布、數(shù)量及動態(tài)變化。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(enzyme cytochemistry)通過酶對特異底物的反應(yīng)并顯色來檢測酶在器官、組織和細(xì)胞內(nèi)的分布及酶活性強(qiáng)弱的一種技術(shù)。原理：酶與底物結(jié)合。檢測方法：光度計、光鏡、電鏡等 。退 出Technology for Cell Biology首

42、頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry，ICC)：利用免疫學(xué)中抗原抗體特異性結(jié)合的原理來定性和定位研究器官、組織和細(xì)胞中的生物活性大分子的技術(shù)。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)標(biāo)記方法：熒光染料標(biāo)記抗體。 膠體金標(biāo)記抗體。酶標(biāo)記抗體 。反應(yīng)方式：直接反應(yīng)標(biāo)記物標(biāo)記一級抗體。間接反應(yīng)標(biāo)記物標(biāo)記二級抗體，可增加信 號強(qiáng)度。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法宮頸鱗癌細(xì)胞的免疫組化染色 顯示NRDR

43、B1蛋白在宮頸鱗癌組織中有特異表達(dá)，棕色為陽性表達(dá)。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、放射自顯影技術(shù)放射性自顯影技術(shù)(autoradiography)：用放射性同位素標(biāo)記生物樣品中的大分子或其前體物質(zhì)，然后通過乳膠感光(鹵化銀還原成為銀原子)，顯示出被標(biāo)記物在組織和細(xì)胞內(nèi)的位置、數(shù)量及其變化。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、放射自顯影技術(shù)同位素：核重量不同。核外電子數(shù)相同，化學(xué)性質(zhì)相同。 放射性同位素（radioisotope）：可衰變釋放出、或射線而被檢測。退 出Te

44、chnology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法常用放射性同位素：14C、3H、35S、32P 。3H-亮氨酸和35S-蛋氨酸蛋白質(zhì)。3H-巖藻糖和3H-甘露醇糖類。3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-胸苷或3H-尿苷核酸。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、放射自顯影技術(shù)操作步驟：放射性化合物摻入活細(xì)胞 ；不同時間取樣制備切片； 暗盒中曝光；顯影和定影。應(yīng)用：對生物樣品中放射性同位素標(biāo)記的某種分子 進(jìn)行定性或定量檢測。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研

45、究方法三、放射自顯影技術(shù)四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤(一)離子探針原理：一些染料專一地與某種離子結(jié)合后會產(chǎn)生熒 光或改變本身熒光的發(fā)射波長與強(qiáng)度，從而 通過熒光檢測可以顯示該離子的量。 應(yīng)用：細(xì)胞內(nèi)離子的實時檢測 。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤(一)離子探針鈣離子探針Fura-2標(biāo)記顯示：CD437誘導(dǎo)TR3/Nur77易位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)紊亂。（汕頭大學(xué)黃東陽提供）退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)綠色熒光蛋白 綠色熒光蛋白（green f

46、luorescent protein，GFP）：含有238個氨基酸殘基，在藍(lán)色光源(450490nm)的激發(fā)下，發(fā)射出綠色熒光(520nm)。 應(yīng)用：顯示特定蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。 構(gòu)建融合基因表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤輔酶II依賴性視黃醇脫氫-還原酶選擇性剪接體亞型（NRDRB1）在Hela細(xì)胞中的定位。(汕頭大學(xué)黃東陽提供)退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(三) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluore

47、scence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）：當(dāng)一個熒光供體與一個熒光受體分子彼此接近而供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜重疊時就會發(fā)生FRET現(xiàn)象，此時能量以非輻射方式由供體轉(zhuǎn)移到受體。 應(yīng)用：實時觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白與蛋白相互作用。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤 單分子熒光成像(single molecular fluorescence imaging)和原子力顯微鏡是活細(xì)胞體系中單分子研究的兩種核心技術(shù)。(四)單分子示蹤 退 出Technology for Cell Biology首

48、 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤1.單分子熒光成像特點：時間分辨率高，樣品激發(fā)范圍小、光子收集效 率高。 成像：全內(nèi)反式熒光顯微鏡和共焦激光掃描顯微鏡。應(yīng)用：活細(xì)胞內(nèi)單分子研究（配體與受體的結(jié)合、蛋 白質(zhì)的聚合和解聚、生物大分子的動力學(xué)行為 等）。(四)單分子示蹤 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、活細(xì)胞內(nèi)分子示蹤2.原子力顯微鏡特點：分辨率高，適合在生理條件下顯示生物分子的 特異性相互作用。 (四)單分子示蹤 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、活細(xì)胞內(nèi)

49、分子示蹤第五節(jié) 細(xì)胞功能基因組學(xué)研究技術(shù)一、基因表達(dá)的定量分析二、基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)技術(shù)三、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 四、蛋白質(zhì)與核酸的相互作用研究技術(shù) 五、生物芯片技術(shù)六、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)七、高通量測序技術(shù)八、模式動物個體水平的基因操作技術(shù) 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(一)印跡雜交技術(shù)是定量檢測基因表達(dá)變化的基 本方法一、基因表達(dá)的定量分析Northern印跡雜交（Northern blot）技術(shù)：檢測組織或細(xì)胞中特異性mRNA的方法。主要過程： RNA提取與電泳分離 印跡 雜交 放射自顯影分析Northern雜交退 出Tec

50、hnology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法（二）原位雜交 原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH）： 將細(xì)胞或組織切片固定于載玻片上，使細(xì)胞 中DNA或RNA在保持原來位置條件下，與標(biāo) 記的核酸探針進(jìn)行原位雜交反應(yīng)，通過放射 自顯影檢測和顯微鏡觀察，對材料中被雜交 的核酸分子進(jìn)行定位、定量分析或觀察基因 表達(dá)（mRNA）的水平。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、基因表達(dá)的定量分析（二）原位雜交退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)

51、胞生物學(xué)研究方法一、基因表達(dá)的定量分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）：是在體外對特定的DNA序列進(jìn)行的重復(fù)性復(fù)制反應(yīng)（擴(kuò)增）。 反應(yīng)體系：模板DNA；耐熱的DNA聚合酶；引物；4種脫氧核苷酸（dNTP）；反應(yīng)緩沖液。(三)熒光實時定量PCR技術(shù)是檢測基因表達(dá)變化的 常規(guī)方法退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、基因表達(dá)的定量分析反應(yīng)步驟：95變性：DNA雙鏈解離；(2)55退火：DNA鏈與引物 互補(bǔ)結(jié)合；(3)72延伸：DNA聚合酶作 用下的互補(bǔ)鏈 合成。(三)熒光實時定量PCR技術(shù)是檢測基

52、因表達(dá)變化的 常規(guī)方法退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、基因表達(dá)的定量分析熒光實時定量PCR反應(yīng)（quantitative PCR，qPCR）：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，在每次反應(yīng)循環(huán)后，檢測反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度。以反應(yīng)管中熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時所需的PCR反應(yīng)循環(huán)個數(shù)（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、基因表達(dá)的定量分析(三)熒光實時定量PCR技術(shù)是檢測基因表達(dá)變化的 常規(guī)方法如上圖所示，qPCR一般使用二步PCR擴(kuò)增，即將退火和

53、延伸整合成一步。一般在退火-延伸整合步驟結(jié)束時進(jìn)行信號檢測。Cp13.015.017.518.020.021.524.025.025.5能夠產(chǎn)生熒光信號的擴(kuò)增產(chǎn)物會隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行而積累。熒光強(qiáng)度超過閾值的循環(huán)數(shù)(Cp值)會被實時檢測出來。Cp值與模板中目的片段的含量正相關(guān)。因此可以用Cp值表示目的片段的初始含量。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、基因表達(dá)的定量分析(三)熒光實時定量PCR技術(shù)是檢測基因表達(dá)變化的 常規(guī)方法二、基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)技術(shù)(一)外源性基因在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)是上調(diào)基因表達(dá)水平的基本方法 cDNA克?。╟DN

54、A cloning）：將mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA或通過體外聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到的基因片段，插入到能進(jìn)行自我復(fù)制的載體（通常是質(zhì)粒），實現(xiàn)在受體細(xì)菌內(nèi)大量擴(kuò)增的過程。 外源性基因可以與表達(dá)載體連接后在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)技術(shù)(一)外源性基因在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)是上調(diào)基因表達(dá)水平的基本方法 轉(zhuǎn)染（transfection）：將帶有外源性基因的克隆載體或表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。在表達(dá)載體啟動子的驅(qū)動下，外源基因?qū)@得過表達(dá)（over-expression），從而實現(xiàn)上調(diào)細(xì)胞中的目的基

55、因表達(dá)。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。(二) RNA干擾技術(shù)是下調(diào)基因表達(dá)的常用方法 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)技術(shù)細(xì)胞內(nèi)RNA干擾機(jī)制(二) RNA干擾技術(shù)是下調(diào)基因表達(dá)的常用方法 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)技術(shù)三、蛋白質(zhì)相互作用的研究技

56、術(shù) (一)免疫沉淀（immuno-precipitation，IP）過程：首先用偶聯(lián)在凝膠顆粒或磁珠上的目的蛋白的抗體將細(xì)胞勻漿或裂解液中的目的蛋白沉淀出來，在此過程中能夠與目的蛋白發(fā)生相互作用的蛋白會被同時沉淀下來。然后用SDS、免疫印跡或生物質(zhì)譜對沉淀出來的蛋白進(jìn)行鑒定。 應(yīng)用：驗證蛋白-蛋白的相互作用。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法免疫沉淀過程退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)酵母雙雜交 酵母雙雜交（yeast two-hybridization）是一種在 體內(nèi)

57、條件下研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。 應(yīng)用：篩選存在相互作用的蛋白質(zhì)。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) (二)酵母雙雜交 原理：退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) (三)噬菌體展示（phage display）應(yīng)用：體外篩選蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) (A)目的多肽呈現(xiàn)在噬菌體表面；(B)應(yīng)用噬菌體展示

58、技術(shù)獲得可與腦瘤血管特異性結(jié)合的多肽的編碼DNA的過程(三)噬菌體展示（phage display）原理：退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 四、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究技術(shù)（一）染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)應(yīng)用：體內(nèi)研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。原理： 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法（二）紫外交聯(lián)免疫沉淀應(yīng)用：研究RNA與RNA結(jié)合蛋白相互作用原理：退 出Te

59、chnology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究技術(shù)退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法五、生物芯片技術(shù) 生物芯片(biochip)是一門由生物學(xué)、微電子學(xué)、物理 學(xué)、化學(xué)和計算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的高 新技術(shù)，主要包括基因芯片和蛋白質(zhì)芯片?；蛐酒╣ene chip）：將大量特定的寡核苷酸片斷作 為探針，排列固定于支持物表面，與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交， 通過檢測雜交信號強(qiáng)度，實現(xiàn)對

60、生物樣品快速、并行、 高效的檢測的一種技術(shù)。基因芯片主要技術(shù)流程是：芯片的設(shè)計與制備，靶基因的 標(biāo)記，芯片雜交，雜交信號檢測。退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法五、生物芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片(protein chip)技術(shù)：將大量蛋白質(zhì) 或多肽固化于固相支持物表面，通過蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)間的相互作用(如抗原抗體反應(yīng)、受體 配體識別等)，對樣品中靶蛋白分子進(jìn)行高通 量檢測的一種技術(shù)。 退 出Technology for Cell Biology首 頁第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法基因芯片主技術(shù)流程退 出Technology for Cell Bio