1、人民醫(yī)院基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 EB病毒核酸定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序項(xiàng)目名稱單純皰疹病毒n型核酸定量檢測(cè)檢驗(yàn)方法名稱TaqMan熒光定量檢測(cè)方法學(xué)原理用一對(duì)EB病毒特異性引物和一條 EB病毒特異性熒光探針， 該探針為一寡核甘酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（R）和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（Q） o探針完整時(shí)，R基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被 Q基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5 -3外切酶活性將探針 酶切降解，使R熒光基團(tuán)和Q熒光基團(tuán)分離，Q基團(tuán)對(duì)R基團(tuán) 的抑制吸收作用消失，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)就可接收到 R基團(tuán)的熒光信 號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成。被切割產(chǎn)生 的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例，這樣就實(shí)現(xiàn)了

2、熒光信 號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此根據(jù) PCR反應(yīng)液的熒 光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。標(biāo)本要求適用標(biāo)本類型：全血。標(biāo)本采集a ）全血：用一次性無(wú)菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二鈉）或枸檬酸鈉抗凝劑的玻 璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合510次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。試齊1J試劑名稱：EB病毒病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒 （PCR-熒光 探針?lè)ǎ┥a(chǎn)廠家：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；試劑貨號(hào)：#DA-B065 ;包裝規(guī)格：20人份/盒；試劑成份：組成部分?jǐn)?shù)量DNA提取液（500山管）2管CT PCR反應(yīng)液（400山管）2管Taq酶（601管）

3、1管EBV陰性質(zhì)控品（150山管）1管EBV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品（200”管）1管EBV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品（200山管）1管EBV陽(yáng)性定量參考品（1.0X104基因拷貝/ml）101管1管EBV陽(yáng)性定量參考品（1.0X105基因拷貝/ml）1管組成部分?jǐn)?shù)量101管EBV陽(yáng)性定量參考品（1.0X106基因拷貝/ml）101管1管EBV陽(yáng)性定量參考品（1.0X107基因拷貝/ml）101管1管5.6 試劑儲(chǔ)存條件：保存于一20 C,有效期6個(gè)月儀器ABI 7500全自動(dòng)基因擴(kuò)增檢測(cè)儀操作步驟DNA提取陰性質(zhì)控品處理a ）取出陰性質(zhì)控品，8,000rpm離心數(shù)秒，吸50皿 至0.5ml 滅菌離心管中，加入 50

4、 H l DNAI取液充分混勻，100。恒 溫處理10 1分鐘；b ） 12000r/min 離心 5min,備用。標(biāo)本處理全血a ）取全血1ml至干燥玻璃試管中，加入生理鹽水1ml輕搖混 勻；b ）取干燥玻璃試管卷入500 d淋巴細(xì)胞分離液;c ）將稀釋好的全血用加樣槍緩慢加入加有淋巴細(xì)胞分離液 的試管中（注意沿管壁，速度要慢）；d ） 2000rpm 離心 20min ；e ）吸取白細(xì)胞層（從上而下的第二層），加入1.5ml離心管， 12000rpm離心5分鐘；12,000 rpm離心5分鐘；f ）去上清，沉淀中加入 50DNA提取液充分混勻，100c 恒溫處理101分鐘；g ） 1200

5、0r/min 離心 5min,備用。EBV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品處理（同陰性質(zhì)控品）；EBV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品處理（同陰性質(zhì)控品）；EBV陽(yáng)性定量參考品處理：8000rpm離心數(shù)秒，備用；PCR擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在試劑準(zhǔn)備區(qū)操作）：按比例（EBV PCR反 應(yīng)液40川人份+ Taq酶3川人份）取相應(yīng)量的 PCR反應(yīng)液及Taq 酶，充分混勻后按43山管分裝至0.2ml離心管中備用。加樣：向準(zhǔn)備好試劑的0.2ml離心管中，分別加入處理 后的樣品（包括樣本、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì) 控品）上清液2小 或直接加入陽(yáng)性定量參考品 2口，8000rpm離 心數(shù)秒，放入儀器樣品槽。設(shè)置PCR循環(huán)擴(kuò)增程序如下93

6、C 2分鐘預(yù)變性；10個(gè)循93 C 45 秒55 C 60 秒93 C 30 秒55 C 45 秒30個(gè)循結(jié)果判斷：如果增長(zhǎng)曲線不呈 S型或Ct值=30,則實(shí)驗(yàn)結(jié)果判為樣 品的HSVII DNA總含量小于檢測(cè)下限。如果增長(zhǎng)曲線呈S型曲線且Ct值30,則：a ）若樣品的C5.00E+003,貝U該樣品的EBV DNA 總含量5.0 x 103基因拷貝/ml；b ）若樣品的 5.00E+003&CW5.00E+007,則該樣品的 EBV DNA總含量=C基因拷貝/ml;c ）若樣品的C5.00E+007,貝，該樣品的EBV DNA 總含量5.0 X107因拷貝/ml。如果需要精確定量結(jié)果，可將提取

7、后的 樣品稀釋至線性范圍內(nèi)再檢測(cè)。質(zhì)控a ）陰性質(zhì)控品：增長(zhǎng)曲線不呈 S型曲線或Ct值=30;b ）陽(yáng)性質(zhì)控品：增長(zhǎng)曲線呈 S型曲線，且強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品定量 參考值在1X106因拷貝/ml2x107因拷貝/ml范圍，臨界 陽(yáng)性質(zhì)控品定量參考值在 2X 102基因拷貝/ml2 x 104基因 拷貝/ml范圍；（參考值為儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的數(shù)值）；c ）陽(yáng)性定量參考品：增長(zhǎng)曲線不呈 S型曲線，Ct值27,且 線性相關(guān)系數(shù)0.97|r|1;d ）以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú) 效，需重新進(jìn)行。參考范圍低于檢測(cè)下限性能指標(biāo)靈敏度:5.0X 103基因拷貝/ml線性范圍：5.0X 103

8、基因拷貝/ml5.0 x 107基因拷貝/ml臨床意義早期診斷：對(duì)于EB病毒急性感染如傳染性單核細(xì)胞增多癥， 最早出現(xiàn)于臨床標(biāo)本中的是病原體本身，采用高靈敏度高特異性的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，可以在感染的早期明確病因。鼻咽癌的監(jiān)測(cè)治療：鼻咽癌具有對(duì)放療敏感， 易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。雖放療為鼻咽癌的首選治療方法， 但其仍有部分患 者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)導(dǎo)致失敗。在臨床上，常會(huì)以常規(guī)體檢、纖維鏡、胸片等作為鼻咽癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)手段，但是這些方法要么缺乏一定的特異性，要么缺乏一定的敏感性，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并實(shí)施早期治療，且不能區(qū)分原發(fā)和轉(zhuǎn)移癌。因此，采 用實(shí)時(shí)熒光PCR直接定量測(cè)定血液中 E

9、B病毒DNA,則可以及 時(shí)準(zhǔn)確的反映其在患者體內(nèi)的消長(zhǎng)情況，作為鼻咽癌治療預(yù)后， 轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。EB病毒屬于皰疹病毒，可引起增殖性感染和非增殖性感染。 特別是非增殖性感染，可導(dǎo)致細(xì)胞癌變。被認(rèn)為與傳染性單核細(xì) 胞增多癥。淋巴癌、胃咽癌、何杰金氏癌、慢性疲勞綜合癥有關(guān)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照 PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī) 范，實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑 準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后 一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū) 各階段用品不能交叉使用；為試劑和標(biāo)本制備階段提供生物安全柜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿工作服，帶一次性手

10、套，使用自卸管移液器；對(duì)每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制；試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；自備滅菌生理鹽水；標(biāo)本處理時(shí)“去上清”步驟，注意吸頭不要碰觸沉淀；試劑盒DNA提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時(shí)需用 加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭現(xiàn)象，可先用潔凈無(wú)污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截;為保證病原體顆粒充分裂解可轉(zhuǎn)至4c靜置68小時(shí)；標(biāo)本制備區(qū)所用過(guò)的吸頭請(qǐng)打入盛有消毒劑的容器，弁與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；實(shí)驗(yàn)完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作 臺(tái)和移液器；所有檢測(cè)樣品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均 需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全 通用準(zhǔn)則和醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例。參考文