1、2021/7/20 星期二1 本課題學(xué)習(xí)目標(biāo) 簡述蛋白質(zhì)提取和分離的基本原理，并了解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2.主要原理：凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法 4、課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。2021/7/20 星期二21.分離生物大分子的基本思路： 選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小

2、、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)?；A(chǔ)知識2021/7/20 星期二3基礎(chǔ)知識（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠： 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 根據(jù)被分離的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理2021/7/20 星期二4分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)方式垂直向下移動(dòng)垂直向下移動(dòng)，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部運(yùn)動(dòng)速度較快較慢運(yùn)動(dòng)路徑較短較長

3、洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來一、基礎(chǔ)知識-蛋白質(zhì)分離和提取的原理2021/7/20 星期二54.具體過程2021/7/20 星期二6凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動(dòng)畫演示2021/7/20 星期二7用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)A路程較長，移動(dòng)速度較慢 B路程較長，移動(dòng)速度較快C路程較短，移動(dòng)速度較慢 D路程較短，移動(dòng)速度較快D2021/7/20 星期二8 （二）緩沖溶液 1.概念: 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。 能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:2021/7/20 星期二

4、93.緩沖溶液的配制: 通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:_ ,其目的是:磷酸緩沖液 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科 學(xué)研究(活性)思考：說出人體血液中緩沖液 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO32021/7/20 星期二10 （三） 電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理： 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)

5、樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(十二烷基磺酸鈉)2021/7/20 星期二11蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。 二、實(shí)驗(yàn)操作2021/7/20 星期二12樣品處理粗 分 離純 化純度鑒定 血液組成成分 1.洗 滌 紅 細(xì) 胞 2.釋放血紅蛋白 3.分離血紅蛋白 4.透析血紅蛋白 二、實(shí)驗(yàn)操作2021/7/20 星期二13血

6、液血漿水 分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì) 胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90）兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)2. 血液有哪些成分？1. 用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白知識回顧2021/7/20 星期二14血紅蛋白兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點(diǎn)：返回2021/7/20 星期二15 二、

7、實(shí)驗(yàn)操作1、紅細(xì)胞的洗滌閱讀思考：洗滌的目的是什么？（P69：操作提示）洗滌過程：血液100mL低速離心2 min紅細(xì)胞血 漿紅細(xì)胞攪拌10min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色3g檸檬酸鈉吸出血漿5倍體積生理鹽水2021/7/20 星期二16初次離心后的結(jié)果2021/7/20 星期二173次洗滌后的結(jié)果返回2021/7/20 星期二182、血紅蛋白的釋放 二、實(shí)驗(yàn)操作閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂2021/

8、7/20 星期二19磁力攪拌器返回2021/7/20 星期二203、分離血紅蛋白溶液過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。紅細(xì)胞混合液高速離心10min 濾紙過濾燒杯離心管分離過程2021/7/20 星期二21甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試

9、管中溶液層次返回 記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機(jī)溶劑-脂類物質(zhì)-血紅蛋白溶液-紅細(xì)胞破碎物沉淀2021/7/20 星期二224、透析 過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。 二、實(shí)驗(yàn)操作原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL2021/7/20 星期二23透析過程動(dòng)畫演示2021/7/20 星期二24利用透析袋透析返回2021/7/20 星期二25純化凝膠色譜操作1.凝膠色

10、譜柱的制作2.凝膠色譜柱的裝填教材圖5193.樣品的加入和洗脫 二、實(shí)驗(yàn)操作2021/7/20 星期二26凝膠色譜操作:1、凝膠色譜柱的制作 取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。2021/7/20 星期二272、凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、

11、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。2021/7/20 星期二28裝配好的凝膠柱2021/7/20 星期二29 洗滌平衡：裝填完畢后，立

12、即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。2、凝膠色譜柱的裝填50cm高2021/7/20 星期二303、樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等

13、樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功） 注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。2021/7/20 星期二313.樣品的加入和洗脫2021/7/20 星期二32（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。2021/7

14、/20 星期二33收集得到的純化后的蛋白2021/7/20 星期二34注意事項(xiàng)1. 紅細(xì)胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時(shí)離心。2. 凝膠的預(yù)處理： 沸水浴法時(shí)間短，還能除去微生物和氣泡3. 色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4. 色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)。2021/7/20 星期二35思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。 1、在血紅蛋白的整個(gè)過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？ 2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？ 血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通

15、過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。 3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？ 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。2021/7/20 星期二36 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外

16、，離心速度過高和時(shí)間過長，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價(jià) 1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？ 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 2021/7/20 星期二37 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評價(jià)總結(jié)以下幾個(gè)問題1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的?2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?3.電泳的作用及其原理是什么