1、第八章核酸雜交技術(shù)第1頁(yè)，共69頁(yè)。第一節(jié) 核酸雜交的概念和原理一、基本原理：DNA的變性和復(fù)性。1、變性：在熱變性過(guò)程中，DNA雙螺旋被解開(kāi)一半時(shí)的溫度稱(chēng)為變性溫度或解鏈溫度（melting-temperature, Tm）。（1）解鏈溫度Tm：每一種DNA都有一個(gè)解鏈溫度，通常Tm值在60 。第2頁(yè)，共69頁(yè)。（2）影響Tm值的因素：DNA堿基組成：G-C含量越多，Tm值越高；溶液的離子強(qiáng)度：低離子強(qiáng)度，Tm值較低，而且解鏈的溫度范圍較寬；高離子強(qiáng)度，Tm值較高，解鏈溫度較窄。 pH值：溶液pH值在59范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。變性劑：各種變性劑主要干擾堿基堆積力和氫鍵的形成而降低Tm值。

2、Tm0.41(GC)%69.3第3頁(yè)，共69頁(yè)。2、復(fù)性：變性的DNA兩條互補(bǔ)單鏈，在適當(dāng)條件下重新締合成雙鏈的過(guò)程為DNA復(fù)性。核酸雜交技術(shù)就是利用DNA變性再?gòu)?fù)性的原理，進(jìn)行的一項(xiàng)核酸檢測(cè)技術(shù)。雜交分子可以在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合成的寡核苷酸單鏈與RNA或DNA單鏈之間形成雜交分子。 第4頁(yè)，共69頁(yè)。二、核酸雜交的概念核酸分子雜交(nucleic acid hybridization)是指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。通過(guò)將標(biāo)記的已知核酸片段作為探針，與待測(cè)標(biāo)本核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)，即可觀察到樣本核酸中相應(yīng)的基因。 第5

3、頁(yè)，共69頁(yè)。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象和手段不同可將雜交枝術(shù)分為不同類(lèi)型，常見(jiàn)的有四種類(lèi)型Southern印跡雜交（DNA印跡雜交）Northern印跡雜交（RNA印跡雜交）原位雜交技術(shù)（in situ hybridization）斑點(diǎn)及狹縫雜交(dot blot hybridization) 根據(jù)雜交體系的不同，核酸雜交可以分為液相雜交和固相雜交。固相雜交是將待測(cè)核酸先固定在固相支持物上，然后與溶液中的游離探針進(jìn)行雜交，形成的雜交體結(jié)合在固相支持物上。第6頁(yè)，共69頁(yè)。第二節(jié) 核酸探針與標(biāo)記一、探針的概念探針（probe)：廣義上講，探針是指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測(cè)的分子。

4、如：抗原抗體，生物素親合素，受體配體等。核酸探針：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補(bǔ)雜交，雜交后又能被特殊方法檢測(cè)的已知的被標(biāo)記的核苷酸鏈。第7頁(yè)，共69頁(yè)。二、探針的種類(lèi)根據(jù)探針的來(lái)源和性質(zhì)可分為：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、cRNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等。選擇探針的原則：1）要有高度的特異性2）容易制備3）靈敏性第8頁(yè)，共69頁(yè)。1、基因組DNA探針（最常用）為某一基因的全部或部分序列，但這些片段必須是特異的。制備：從基因文庫(kù)選取某一基因片段，進(jìn)行克隆后酶切獲得。也可以應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA特定片段。優(yōu)點(diǎn)：1）多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，制備方法

5、簡(jiǎn)單2）相對(duì)RNA而言DNA探針不易降解3）DNA探針標(biāo)記方法較成熟。第9頁(yè)，共69頁(yè)。2、cDNA探針cDNA（complementary)是互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。它是以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase)催化合成的DNA。優(yōu)點(diǎn)：不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列缺點(diǎn)：不易獲得，限制了其應(yīng)用。第10頁(yè)，共69頁(yè)。3、RNA探針mRNA探針是一類(lèi)有特殊用途的核酸探針。優(yōu)點(diǎn)：1）因是單鏈，所以與靶序列雜交效率高。2）因無(wú)高度重復(fù)序列，所以雜交特異性也高。缺點(diǎn)：1）易降解；2）標(biāo)記方法復(fù)雜用途：1）可用于檢測(cè)DNA和mRNA 2）在研究基因表達(dá)時(shí)，

6、常用于觀察該基因的轉(zhuǎn)錄情況。第11頁(yè)，共69頁(yè)。4、寡核苷酸探針（人工合成）優(yōu)點(diǎn)：1）可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列2）探針短，序列復(fù)雜性低，容易與靶點(diǎn)完全雜交。 3）長(zhǎng)度只有1015bp，從而能降低雜交Tm值。 4）可大量合成，使該探針價(jià)格低。第12頁(yè)，共69頁(yè)。三、探針標(biāo)記物探針標(biāo)記物的特性：1）具有高度靈敏性，高度特異性。2）標(biāo)記物與探針結(jié)合后，不影響雜交時(shí)堿基配對(duì)，也不影響探針的主要理化特性。3）檢測(cè)方法假陽(yáng)性率低，價(jià)格低，對(duì)環(huán)境污染少。4）若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對(duì)酶的活性影響不大。第13頁(yè)，共69頁(yè)。（一）放射性同位素標(biāo)記物（最常用）優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)特異性強(qiáng)，靈敏度高，對(duì)各種酶促反應(yīng)無(wú)影響，也不影響

7、堿基配對(duì)。缺點(diǎn)：容易造成放射性污染常用同位素：32P，3H，35S也有用131I，14C在Southern印跡雜交中以32P最常用。32P 主要以-32PNTP 或-32PdNTP 形式通過(guò)酶促反應(yīng)摻入核酸探針，第14頁(yè)，共69頁(yè)。（二）非放射性標(biāo)記物根據(jù)檢測(cè)方法不同，分為：1、半抗原：生物素（biotin)和地高辛（DIG)較常用。半抗原與抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。（較常用）2、配體：生物素還是親合素（avidin)的配體。3、熒光素：如異硫氰酸熒光素（FITC)和羅丹明，可被紫外線(xiàn)激發(fā)出熒光而被檢測(cè)到。4、化學(xué)發(fā)光探針：一些標(biāo)記物可與某種物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。第15頁(yè)，共69頁(yè)。生物素-11

8、-dUTP生物素是親和素（avidin）的天然配體。用生物素化探針與待測(cè)核酸雜交之后，可以用偶聯(lián)有報(bào)道酶（例如堿性磷酸酶）的親和素與雜交體結(jié)合，然后，加報(bào)道酶底物（例如堿性磷酸酶的底物X-磷酸酯），通過(guò)呈色反應(yīng)或產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物進(jìn)行分析第16頁(yè)，共69頁(yè)。四、探針標(biāo)記方法核酸標(biāo)記可以在體內(nèi)進(jìn)行，也可以在體外進(jìn)行。體外標(biāo)記法分為化學(xué)法和酶促法?；瘜W(xué)法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針?lè)肿由系幕鶊F(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)將標(biāo)記物直接連接到探針?lè)肿由稀Ｃ复俜ǎ簩?biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻入到探針?lè)肿又小５?7頁(yè)，共69頁(yè)。1、切口平移法（nick translation)（最

9、常用）用大腸桿菌的DNA聚合酶I將DNA分子的一條鏈上隨機(jī)切開(kāi)若干切口（nick)，切口處形成3 -OH末端再在DNA聚合酶I的催化下，在切口3 -OH末端逐個(gè)加上新的dNTP（其中有一種預(yù)先標(biāo)記了 32P）。利用本法可以制備序列特異的探針切口平移標(biāo)記探針平均長(zhǎng)度約為600個(gè)核苷酸。第18頁(yè)，共69頁(yè)。5ATCGTAGCGATTAGGCCTACCGA33TAGCATCGCTAATCCGGATGGCT5切口平移法（nick translation)DNA聚合酶I假設(shè)：dGTP用32P第19頁(yè)，共69頁(yè)。用DNase在DNA 雙鏈上隨機(jī)切割磷酸二酯鍵，形成多個(gè)切口；利用大腸桿菌DNA 聚合酶通過(guò)切

10、口平移降解原有DNA 片段，用標(biāo)記核苷酸作為底物合成標(biāo)記DNA 片段；除去未摻入的標(biāo)記核苷酸，獲得DNA 探針。第20頁(yè)，共69頁(yè)。2、隨機(jī)引物法（random priming)隨機(jī)引物是人工合成的一段含有68個(gè)核苷酸的寡核苷酸片段。這段寡核苷酸片段隨機(jī)與已經(jīng)變性的DNA或RNA單鏈結(jié)合。在反應(yīng)體系中加入大腸桿菌DNA聚合酶I Klennow片段和dNTP（預(yù)先用 32P標(biāo)記），在寡核苷酸的3 -OH末端，互補(bǔ)合成一條新的DNA鏈，這條鏈就是被標(biāo)記的探針。第21頁(yè)，共69頁(yè)。3ATCGTAGCGATTAGGCCTACCGA55TAGCA3隨機(jī)引物法（random priming)Klennow

11、片段假設(shè)：dGTP用32P第22頁(yè)，共69頁(yè)。將探針模板變性，與隨機(jī)引物退火；加Klenow 片段，以一種標(biāo)記dNTP 和三種普通dNTP 為底物，合成標(biāo)記DNA；變性解鏈，得到標(biāo)記DNA 探針第23頁(yè)，共69頁(yè)。3、末端標(biāo)記法1）5 末端標(biāo)記本法要求DNA或RNA分子5 末端是-OH先用堿性磷酸酶切除DNA或RNA5 末端的磷酸基團(tuán)，使其成為5 OH然后，在32PATP存在下，經(jīng)T4噬菌體多核苷酸激酶（polynucleotide kinase,PNK)催化下，將位上的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA分子的5-OH末端。第24頁(yè)，共69頁(yè)。2）3 末端標(biāo)記用小牛胸腺末端轉(zhuǎn)移酶，在3 -OH末端連接

12、一個(gè) 32PdATP末端標(biāo)記法一般很少用于核酸雜交，常用于DNA測(cè)序。第25頁(yè)，共69頁(yè)。3）替代合成標(biāo)記法對(duì)于3黏端和平端DNA，利用T4 DNA 聚合酶和Klenow 片段的35外切酶活性，可以將其外切成5黏端，然后再利用T4 DNA 聚合酶和Klenow 片段的53聚合酶活性，加入標(biāo)記dNTP 底物進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于具有5黏端的DNA，可以直接利T4DNA 聚合酶和Klenow 片段的53聚合酶活性，加入標(biāo)記dNTP 底物進(jìn)行標(biāo)記。第26頁(yè)，共69頁(yè)。4、PCR標(biāo)記法在PCR反應(yīng)底物中，加入標(biāo)記了的dNTP，這樣，標(biāo)記了的dNTP就可以在PCR反應(yīng)的同時(shí)摻入到新合成的DNA鏈上。可以作為探針

13、。聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記法適合于合成短鏈探針第27頁(yè)，共69頁(yè)。五、探針的純化常用的探針純化方法有乙醇沉淀法和凝膠過(guò)濾法。1.乙醇沉淀法 DNA 片段可以被無(wú)水乙醇沉淀，而dNTP 等小分子物質(zhì)則留于上清液中。因此，用無(wú)水乙醇沉淀23 次即可將探針與其他成分分離，達(dá)到純化目的。乙醇沉淀法操作簡(jiǎn)便，是純化探針的首選方法。2.凝膠過(guò)濾法 凝膠過(guò)濾法是利用凝膠的分子篩特性，將大分子核酸與小分子dNTP有效分離。常用的凝膠填料是Sephadex G-50 和Bio-Gel P-60。如果洗脫液體積過(guò)大，可以用乙醇沉淀法進(jìn)行濃縮。第28頁(yè)，共69頁(yè)。第三節(jié)固相支持物與印跡一、固相支持物1.硝酸纖維素膜 硝酸纖

14、維素膜是最早用于固定DNA 的固相膜，優(yōu)點(diǎn)：本底較低、操作簡(jiǎn)便。被廣泛應(yīng)用于DNA 印跡、RNA 印跡和斑點(diǎn)雜交等。缺點(diǎn)：核酸與硝酸纖維素膜以疏水作用結(jié)合，因而結(jié)合不太牢固，在雜交之后的洗膜過(guò)程中可能會(huì)被洗脫；核酸與硝酸纖維素膜的結(jié)合受離子強(qiáng)度影響，需要較高的離子強(qiáng)度；硝酸纖維素膜在堿性條件下不能結(jié)合核酸，并且長(zhǎng)時(shí)間置于堿性溶液中會(huì)破裂，所以不適合于在堿性溶液中使用；硝酸纖維素膜在真空80 烘烤固定時(shí)會(huì)變脆，很難進(jìn)行多輪雜交。第29頁(yè)，共69頁(yè)。2.尼龍膜 尼龍膜韌性較強(qiáng)，不易破裂。在酸性、堿性、中性、各種離子強(qiáng)度條件下，核酸均可以共價(jià)鍵與尼龍膜結(jié)合，非常牢固。在保持完整的情況下，尼龍膜可以多

15、輪雜交，即在第一輪雜交之后，將探針?lè)肿幼冃韵疵?，可以再與第二種探針雜交。用于印跡雜交的尼龍膜有普通尼龍膜和正電荷修飾尼龍膜兩種。正電荷修飾尼龍膜與核酸的結(jié)合能力更強(qiáng)，靈敏度更高。第30頁(yè)，共69頁(yè)。二、印跡方法印跡（blotting）是指將凝膠中的待測(cè)核酸等樣品用類(lèi)似于吸墨跡的方法轉(zhuǎn)移到固相膜上，轉(zhuǎn)移之后待測(cè)樣品在固相膜上的相對(duì)位置保持不變。1.毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法 利用虹吸作用使緩沖溶液定向滲透，帶動(dòng)樣品從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相膜上。樣品轉(zhuǎn)移速度主要取決于樣品分子大小、凝膠濃度和凝膠厚度。有兩種毛細(xì)管法：向上毛細(xì)管法：液流自下而上虹吸向下毛細(xì)管法：液流自上而下虹吸，第31頁(yè)，共69頁(yè)。向上毛細(xì)管法：液流自

16、下而上虹吸向下毛細(xì)管法：液流自上而下虹吸，第32頁(yè)，共69頁(yè)。2真空轉(zhuǎn)移法 是利用真空作用將緩沖溶液從上層儲(chǔ)液器中通過(guò)凝膠和固相膜抽到下層真空室內(nèi)，同時(shí)帶動(dòng)樣品分子移出，結(jié)合到固相膜上。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、高效，并且可以在轉(zhuǎn)移的同時(shí)對(duì)核酸進(jìn)行變性和中和處理。注意事項(xiàng)：保持凝膠表面平整，厚度均勻，否則在真空作用下凝膠會(huì)破裂；在轉(zhuǎn)移過(guò)程中真空度不宜過(guò)高，以免凝膠被壓緊，反而降低轉(zhuǎn)移效率。第33頁(yè)，共69頁(yè)。3電轉(zhuǎn)移法 是通過(guò)電泳使凝膠中的帶電荷樣品沿著與凝膠平面垂直的方向泳動(dòng)，從凝膠中移出，結(jié)合到固相膜上，是一種簡(jiǎn)便、快速、高效的轉(zhuǎn)移方法。核酸電轉(zhuǎn)移法一般選用尼龍膜而不是硝酸纖維素膜作為固相膜第34

17、頁(yè)，共69頁(yè)。第四節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)一、 Southern印跡雜交（Southern blotting)又叫DNA印跡技術(shù)。是1975年由英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的 E.Southern發(fā)明的。該技術(shù)是DNA與DNA的雜交。Southern印跡雜交是將電泳分離的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定固相支持物上與探針雜交，用標(biāo)記過(guò)的探針檢測(cè)待測(cè)DNA的一種方法。 第35頁(yè)，共69頁(yè)。（一）基本步驟樣品制備電泳分離變性印跡固定預(yù)雜交雜交洗膜檢測(cè)與分析第36頁(yè)，共69頁(yè)。1、樣品制備 基因組DNA是從動(dòng)物細(xì)胞或組織中提取。1）破碎細(xì)胞：化學(xué)法裂解細(xì)胞， 用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞 。2）用蛋白酶和RNA酶消

18、化大部分蛋白質(zhì)和RNA 。3）用有機(jī)溶劑（酚氯仿）抽提的方法除去殘余蛋白質(zhì)。 4）用限制性核酸內(nèi)切酶消化，將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析。第37頁(yè)，共69頁(yè)。2、電泳分離將制備好的DNA樣品在0.8%1.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離DNA。 3、DNA的變性電泳結(jié)束后，對(duì)凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性及中和處理。將凝膠置于堿溶液中浸泡，使DNA原位變性解鏈，形成單鏈DNA片段，再用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液。第38頁(yè)，共69頁(yè)。 4、印跡將變性后的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程稱(chēng)為印跡。5、固定 轉(zhuǎn)移之后的DNA 必須固定于固相膜上。80 烘烤可以將DNA 固定于固相膜上，小劑

19、量紫外線(xiàn)可以使DNA 以共價(jià)鍵與尼龍膜結(jié)合。第39頁(yè)，共69頁(yè)。6、預(yù)雜交和雜交預(yù)雜交：將固定后的DNA樣品用變性的鮭魚(yú)精子DNA等非特異性的DNA分子封閉固相膜上未結(jié)合DNA的位點(diǎn)，以避免探針的非特異性結(jié)合，降低雜交的本底。雜交：加入標(biāo)記好的探針進(jìn)行雜交。 用探針雜交液浸泡結(jié)合了待測(cè)DNA 的固相膜，溫育，探針即與待測(cè)DNA 片段進(jìn)行雜交。第40頁(yè)，共69頁(yè)。7、洗膜 用不同離子強(qiáng)度的漂洗液依次漂洗固相膜，除去末雜交探針和形成非特異性雜交體的探針，稱(chēng)為洗膜。非特異性雜交體穩(wěn)定性差，解鏈溫度低，可以在比特異性雜交體解鏈溫度低5l2 的條件下解鏈，而特異性雜交體不會(huì)解鏈。第41頁(yè)，共69頁(yè)。8、

20、檢測(cè)與分析雜交信號(hào)的檢測(cè)方法有兩種：一種是放射自顯影。用于同位素或發(fā)光劑標(biāo)記的核酸探針與待測(cè)DNA雜交洗膜后，將纖維素膜和X光片一起裝入暗盒，使X光片曝光，沖洗后，在X光片上可見(jiàn)黑色條帶。另一種是化學(xué)染色?？芍苯釉谀ど巷@色，顯出雜交條帶。 第42頁(yè)，共69頁(yè)。（二）應(yīng)用Southern雜交技術(shù)主要用于：組建DNA物理圖譜。研究基因重排，變異以及基因的限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。用于對(duì)疾病的診斷。 第43頁(yè)，共69頁(yè)。二、Northern印跡雜交（Northern blotting）1979年J.C Alwine將RNA轉(zhuǎn)移到化學(xué)修飾的活性濾紙上而發(fā)明此法。1、概念：Northern印跡

21、雜交是將RNA從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種方法。 用于檢測(cè)RNA（主要是mRNA）,用于研究基因表達(dá)。 第44頁(yè)，共69頁(yè)。2、基本步驟：提取細(xì)胞總RNA或mRNA直接進(jìn)行電泳分離。為了維持RNA的單鏈狀態(tài)，防止RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在凝膠中需要加入變性劑。電泳結(jié)束后，直接采用毛細(xì)管虹吸法將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到纖維膜上與探針雜交。3、應(yīng)用：Northern雜交技術(shù)用于檢測(cè)各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小、轉(zhuǎn)錄量及其變化。第45頁(yè)，共69頁(yè)。三、原位雜交（in situ hybridization）1、概念：不改變核酸所在的位置，直接與探針雜交的方法。 2、種

22、類(lèi)：菌落原位雜交技術(shù) ：用于鑒別陽(yáng)性重組克隆細(xì)菌 。細(xì)胞內(nèi)和染色體原位雜交技術(shù)：用于觀察某些基因在組織細(xì)胞中的表達(dá)狀況和基因染色體定位 第46頁(yè)，共69頁(yè)。菌落原位雜交過(guò)程：用固相膜拓印培養(yǎng)菌落或噬菌斑，并做相應(yīng)標(biāo)記；用堿液處理拓膜菌落或噬菌斑，原位裂解釋放DNA 并固定；進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和分析。第47頁(yè)，共69頁(yè)。四、斑點(diǎn)及狹逢雜交(dot blot hybridization) 1、概念：將核酸樣品變性后直接點(diǎn)在硝酸纖維膜上，再與探針進(jìn)行雜交。斑點(diǎn)印跡為圓形，狹縫印跡是線(xiàn)狀。 2、應(yīng)用：用于分析細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化和基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。 用于鑒定陽(yáng)性重組克隆，檢測(cè)病原性微生物和生物制品中的

23、核酸污染狀況第48頁(yè)，共69頁(yè)。五、等位基因特異性寡核苷酸雜交等位基因特異性寡核苷酸雜交法（ASOH）是最早用于檢測(cè)點(diǎn)突變的方法，也是目前廣泛采用的基因診斷方法，由Wallace 于1979 年建立。原理：人工設(shè)計(jì)一對(duì)等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO），長(zhǎng)度1520 nt，兩種探針序列只有一個(gè)堿基不同，該堿基對(duì)應(yīng)突變堿基，因而一種探針與正常基因序列完全互補(bǔ)，為正常探針；另一種探針與突變基因序列完全互補(bǔ)，為突變探針。第49頁(yè)，共69頁(yè)。例：診斷苯丙酮酸尿癥（PKU）苯丙酮酸尿癥是一種AR遺傳，由于點(diǎn)突變?cè)斐杀奖彼崃u化酶（PHA）缺乏或不足引發(fā)此病。我國(guó)人群發(fā)病率為1/16000.人PHA基因

24、位于12q22-12q24.1，全長(zhǎng)90kb，其中包括13個(gè)外顯子，共編碼451個(gè)氨基酸。第50頁(yè)，共69頁(yè)。我們根據(jù)某個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)，如Arg243Gln，設(shè)計(jì)一對(duì)引物：正常探針：TTCCGCCTCCGACCTGT突變探針：TTCCGCCTCCAACCTGT雜交結(jié)果如下第51頁(yè)，共69頁(yè)。第五節(jié)影響雜交的因素1.雜交溫度 影響雜交效率：當(dāng)雜交溫度比解鏈溫度低2025 時(shí)，DNA-DNA 雜交效率最高。如果繼續(xù)提高溫度，雜交體將趨向于變性解鏈。影響核酸雜交的特異性。雜交溫度越接近解鏈溫度，堿基錯(cuò)配越少。當(dāng)雜交溫度比解鏈溫度低1015 時(shí)，堿基錯(cuò)配極少。在實(shí)際操作中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要確定合適的雜交溫度

25、最適雜交溫度。2.離子強(qiáng)度和甲酰胺濃度 離子強(qiáng)度影響解鏈溫度，因而影響最適雜交溫度。在同一溫度下，降低離子強(qiáng)度可以減少堿基錯(cuò)配，但雜交緩慢；如果提高離子強(qiáng)度，雜交會(huì)加快，但堿基錯(cuò)配也隨之增加。某些有機(jī)溶劑例如甲酰胺，也可以降低最適雜交溫度。甲酰胺濃度每增加1%，最適雜交溫度可以降低0.72 。如果在雜交液中加入30%50%的甲酰胺，其最適雜交溫度能降到3042 。第52頁(yè)，共69頁(yè)。第五節(jié)影響雜交的因素3. 探針?lè)N類(lèi)和濃度 如果使用單鏈探針，雜交效率會(huì)隨著探針濃度的增加而增加；如果使用雙鏈探針，探針濃度過(guò)高反而會(huì)影響雜交效率，因?yàn)殡p鏈探針雖然在雜交前已經(jīng)變性解鏈，但在最適雜交溫度下，探針很容易

26、復(fù)性。4.核酸分子大小和濃度 核酸的濃度直接影響核酸鏈的碰撞幾率，濃度越高，雜交越快；核酸分子越大，其擴(kuò)散速度越慢，并且越難以形成正確配對(duì)，因而雜交越慢。5.雜交時(shí)間 如果其他條件都已經(jīng)得到優(yōu)化，雜交的效果就取決于雜交時(shí)間。如果雜交時(shí)間過(guò)短，雜交會(huì)不完全；如果雜交時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生非持異性雜交。一般將雜交時(shí)間控制在20 小時(shí)左右。第53頁(yè)，共69頁(yè)。第五節(jié)影響雜交的因素6. 雜交促進(jìn)劑 惰性多聚體可以作為雜交促進(jìn)劑，促進(jìn)長(zhǎng)度大于250 nt 的探針的雜交。硫酸葡聚糖和聚乙二醇是目前最常用的雜交促進(jìn)劑，但硫酸葡聚糖（dextran sulfate）分子太大，會(huì)增加雜交液黏度；聚乙二醇（PEG）黏度

27、低，價(jià)格低廉，但在某些條件下會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的本底。因此，使用雜交促進(jìn)劑需要優(yōu)化雜交條件。短的探針由于分子量小，復(fù)雜程度低，容易進(jìn)行雜交，一般不使用雜交促進(jìn)劑。7非特異性雜交 在雜交前應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行預(yù)雜交，即用封閉物封閉非特異性雜交位點(diǎn)，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附。第54頁(yè)，共69頁(yè)。第六節(jié) 基因芯片基因芯片（gene chip）也稱(chēng)為DNA 芯片（DNA chip）、DNA 微陣列（DNA microarray）、寡核苷酸微陣列（oligonucleotide array）等，是專(zhuān)門(mén)檢測(cè)核酸的生物芯片。原理：也是基于核酸分子雜交，屬于固相雜交。所不同的是探針固相化、集成化；而待測(cè)樣品被標(biāo)記并且游離于

28、液相第55頁(yè)，共69頁(yè)?；蛐酒c固相雜交比較第56頁(yè)，共69頁(yè)。一、基本原理和基本操作基因芯片技術(shù)是以斑點(diǎn)雜交為基礎(chǔ)建立的高通量檢測(cè)DNA 的技術(shù)。（一）基本原理：先將大量已知序列的DNA 或cDNA 片段作為探針按照一定的陣列高密度固定于基片表面，這樣陣列中的每一個(gè)點(diǎn)實(shí)際上代表了一種特定基因，然后與經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的待測(cè)核酸進(jìn)行雜交。用專(zhuān)門(mén)儀器檢測(cè)芯片上的雜交信號(hào)，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分析處理，獲得待測(cè)核酸的各種信息。第57頁(yè)，共69頁(yè)。（二）基本操作1.芯片制作（1）原位合成法：原位合成法（in situ synthesis）是指直接在基片上合成寡核苷酸。光引導(dǎo)原位合成法，所用基片上帶有由光敏保護(hù)基團(tuán)

29、保護(hù)的活性基團(tuán)制作過(guò)程：用掩膜（mask）掩蓋基片，只暴露特定區(qū)域，然后用光照除去暴露區(qū)域活性基團(tuán)上的光敏保護(hù)基團(tuán)，使活性基團(tuán)游離；加入一種被同樣的光敏保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的核苷酸，并化學(xué)連接到游離的活性基團(tuán)上。重復(fù)上述步驟，最終制成基因芯片第58頁(yè)，共69頁(yè)。原位合成法第59頁(yè)，共69頁(yè)。（2）微量點(diǎn)樣法：先制備寡核苷酸探針或cDNA 探針，再用專(zhuān)門(mén)的全自動(dòng)點(diǎn)樣儀按照一定順序點(diǎn)印到基片表面，使探針通過(guò)共價(jià)交聯(lián)或靜電吸附作用固定于基片上，形成微陣列。點(diǎn)樣主要有噴墨打印和接觸打印兩種方式。噴墨打印法是利用壓電晶體或其他技術(shù)將探針溶液通過(guò)微孔噴射到基片表面，產(chǎn)生的液滴體積可以在11092.5102l。接觸

30、打印法是用較為堅(jiān)硬的點(diǎn)樣針蘸取少量探針溶液，然后接觸基片，在基片表面留下探針斑點(diǎn)。斑點(diǎn)直徑由點(diǎn)樣針、探針溶液和基片表面的性質(zhì)共同決定。第60頁(yè)，共69頁(yè)。2樣品制備 樣品制備包括從組織細(xì)胞內(nèi)分離純化RNA 和基因組DNA 等樣品、對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。標(biāo)記物主要是熒光素和生物素等，其中以熒光素最為常用。一般將待測(cè)樣品和對(duì)照樣品分別用Cy3 和Cy5 進(jìn)行標(biāo)記，這樣與芯片雜交之后可以清楚地了解兩種樣品中基因表達(dá)的異同。擴(kuò)增和標(biāo)記可以采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和聚合酶鏈反應(yīng)等。第61頁(yè)，共69頁(yè)。3分子雜交 將雜交液滴到芯片上，或?qū)⑿酒腚s交液中，在一定條件下使待測(cè)DNA 與芯片探針陣列進(jìn)行雜交。雜交之后，

31、用漂洗液漂洗芯片，除去末雜交的DNA。基因芯片雜交的一個(gè)特點(diǎn)是反應(yīng)體系內(nèi)探針的含量顯著高于待測(cè)DNA 的含量，所以雜交信號(hào)的強(qiáng)弱與待測(cè)DNA 的含量成正比。雜交條件將決定雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。雜交條件包括雜交液的離子強(qiáng)度、雜交溫度和雜交時(shí)間等。在實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)探針的長(zhǎng)度、類(lèi)型、所帶電荷、G/C 含量、芯片類(lèi)型和研究目的等因素，對(duì)雜交條件進(jìn)行優(yōu)化。第62頁(yè)，共69頁(yè)。4檢測(cè)分析 用芯片檢測(cè)儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描處理，根據(jù)芯片上每個(gè)位點(diǎn)的探針序列即可知道待測(cè)DNA 的堿基序列，從而獲得待測(cè)DNA 的信息。檢測(cè)結(jié)果一般可以獲得三種陽(yáng)性雜交圖像：Cy3（ex554nm，em568nm）標(biāo)記的待測(cè)樣品與芯片探

32、針結(jié)合，形成紅色雜交點(diǎn)，說(shuō)明待測(cè)樣品中存在探針基因高表達(dá)；Cy5（ex652nm，em672nm）標(biāo)記的對(duì)照樣品與芯片探針結(jié)合，形成綠色雜交點(diǎn)，說(shuō)明對(duì)照樣品中存在探針基因高表達(dá)；兩種待測(cè)DNA 都與芯片探針結(jié)合，形成黃色雜交點(diǎn)，說(shuō)明兩種樣品中都存在探針基因高表達(dá)第63頁(yè)，共69頁(yè)。基因芯片技術(shù)分析基因表達(dá)第64頁(yè)，共69頁(yè)。二、應(yīng)用1.DNA 測(cè)序 應(yīng)用基因芯片進(jìn)行的DNA 測(cè)序?qū)儆陔s交測(cè)序（SBH）基本原理是：在芯片上固定一定長(zhǎng)度寡核苷酸所有序列的探針，和待測(cè)序DNA 雜交。從理論上講，任意待測(cè)DNA 序列都有相應(yīng)探針與之雜交。根據(jù)雜交探針的重疊序列進(jìn)行排列分析，即可確定待測(cè)DNA 序列。例如