1、畢業(yè)論文（2012 屆）題 目：學(xué)生姓名組培工作中影響植物生根因素的探究 杜萬(wàn)雙李仕椿李榮彭俊杰 代劍楠李鑫所在學(xué)院重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院專(zhuān) 業(yè)：生物制藥指導(dǎo)老師：熊竹2011年11月組培工作中影響植物生根因素的探究專(zhuān)業(yè)：生物制藥技術(shù)指導(dǎo)教師熊竹（重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系09級(jí)制藥）摘要：實(shí)驗(yàn)以?xún)煞N青屬植物品種的腋芽為外植體，研究不同外源激素以 及光質(zhì)對(duì)青屬植物離體生根快繁的影響，為組培行業(yè)對(duì)大批量植物快速 培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用的是單因素法，即分析每個(gè)試樣以及所 對(duì)應(yīng)的外激素含量，光質(zhì)對(duì)生根速度和質(zhì)量的影響。過(guò)程中做了大量對(duì) 照實(shí)驗(yàn)，根部還原糖的測(cè)定，生根情況的對(duì)照，并做了相應(yīng)

2、的分析，結(jié) 果表明：光對(duì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化的作用不明顯，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈 傷組織誘導(dǎo)、分化的作用十分顯著，青屬植物試管苗生根培養(yǎng)基為/ 2MS+6一BA 0. 1 mol/ L+IBA0.2mol/L+NAA 1.0 mol/L，繁殖情況最好， 平均生根率達(dá)76.8 %。關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；外源激素；光質(zhì)；還原糖測(cè)定；Tissue culture of plant root on factors of influenceMajor: Biopharmaceutical Technology Supervisor:xiongzhu (chongqingindustry&tradevocation

3、altechnicalcollegeof biologicalchemistryengineering09 levelpharmaceutical)Abstract:t Experiment with two green plants varieties of axillary buds as the explants, different light quality on the study of exogenous hormones and green plants in vitro rooting of tissue culture rapid propagation effect, i

4、ndustry of large quantities of plant rapid culture provides basic data. Experiment is the single factor method, namely the analysis of each specimen and the corresponding external hormone content, quality on rooting rate and mass effect. In the process to do a large number of control experiment, the

5、 root for determination of reducing sugar, rooting condition control, and the corresponding analysis, the results show that: the light on callus induction, differentiation and the effect is not apparent, growth regulating substances on callus induction, differentiation of the role is very significan

6、t, green is a genus of rooting medium for tube seedling for the1 / 2MS+6BA0.1 mol/ L+IBA0.2mol/L+NAA 1mol/L, multiply situation best, average rooting rate was 83.33%,.Keywords： Tissue culture; exogenous hormone; light quality; Determination of reducing sugar;植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)30年代初期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)生物技術(shù)。它 是在人工配制的培養(yǎng)基

7、上，于無(wú)菌狀態(tài)下培養(yǎng)植物器官、組織、細(xì)胞、 原生質(zhì)體等材料的方法。植物細(xì)胞的全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基 礎(chǔ)。20世紀(jì)初，曾有人提出能否將植物的薄壁細(xì)胞培養(yǎng)成完整植株？研 究者從胡蘿卜根的韌皮部取下一塊組織，并在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其 分化出了愈傷組織，從愈傷組織又得到胚狀體，胚狀體轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng) 基上繼續(xù)培養(yǎng)后，獲得了完整的胡蘿卜試管植株。植物組織培養(yǎng)作為一 種有效的技術(shù)手段已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的各個(gè)領(lǐng)域。根據(jù)植物組織 培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀，和植物組織培養(yǎng)在植物學(xué)研究、育種學(xué)研究的基 礎(chǔ)地位和在林木花卉育苗產(chǎn)業(yè)中的科技支撐與保障作用，我國(guó)研究工作 者通過(guò)對(duì)植物組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題進(jìn)行分析，結(jié)

8、合當(dāng)前國(guó)內(nèi)外在這一 領(lǐng)域的一些范例，提出了我國(guó)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展對(duì)策與展望。園藝植物組培苗工廠化生產(chǎn)能快速將優(yōu)良品種轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)力， 在遺傳育種、種質(zhì)資源保護(hù)、次生代謝物利用上也將有很大的發(fā)展?jié)摿Α?只要選好優(yōu)良品種，合理布局、節(jié)約成本，組培產(chǎn)業(yè)將會(huì)有蓬勃的發(fā)展 和廣闊的前景。組培行業(yè)不僅縮短了生長(zhǎng)周期，節(jié)約了生產(chǎn)成本，增加 就業(yè)崗位，使社會(huì)和諧、安定、團(tuán)結(jié)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料金銀花腋芽，梔子花腋芽；MS培養(yǎng)基；6-BA,IBA,NAA;光照培養(yǎng)箱; 超凈工作臺(tái);紫外分光光度計(jì)；滅菌鍋；電子天平；三角瓶；酸度計(jì)；蒸 餾裝置；游標(biāo)卡尺（直尺）；葡萄糖標(biāo)液，硫酸銅，酒石酸鈉，亞鐵氰化鉀，

9、氫氧化鈉1.2實(shí)驗(yàn)步驟及方法1.2.1MS培養(yǎng)基的配置：母液I、母液II及母液IV的配制方法是：每種母液中的幾種成 分稱(chēng)量完畢后，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶， 最后定容到1 L。母液III的配制方法是：將稱(chēng)好的FeSO - 7HO和Na -EDTA - 2H O 分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙?，然后? 兩種溶液混合，并將pH調(diào)至6.5左右，最后定容到1 L，保存在棕 色玻璃瓶中。各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標(biāo)簽， 注明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。MS培養(yǎng)基中還需要加入：蔡乙酸(NAA)、6-茉基嘌吟(6-BA)等植

10、物 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且分別配成母液(1 mg/mL)待用。其配制方法是： 分別稱(chēng)取這3種物質(zhì)各10 mg，將2, 4-D和NAA用少量(1 mL)無(wú)水 乙醇預(yù)溶，將6-BA用少量(1 mL)的物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的 NaOH溶液溶解，溶解過(guò)程需要水浴加熱，最后分別定容至100 mL， 即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的母液。外源激素1236-BA0.10.30.5IBA0.20.50.8NAA1.02.03.0表一植物激素種類(lèi)和濃度1.2.3腋!芽的前處理:取下金銀花和梔子花的腋芽組織，漂洗上面的雜質(zhì)，將洗好的材料 放入75%的酒精中30S，然后放入蒸餾水中漂洗十凈后，放在滅菌紗布

11、 上瀝干；培養(yǎng)原理與方法:外源激素的研究:將滅好菌的培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)，當(dāng)培養(yǎng)基降到45C左右并貼 好標(biāo)簽，將處理好的材料按標(biāo)簽所示接種培養(yǎng)基中，做正交實(shí)驗(yàn)。放入 26C的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，觀察生根繁殖情況，做記錄。表二正交實(shí)驗(yàn)安排1.2.5 .光質(zhì)的探究：選正交實(shí)驗(yàn)第一組外源激素的配比的培養(yǎng)基，將處理好的金銀花， 和梔子花腋芽接種到培養(yǎng)基中。分別放入培養(yǎng)箱帶有白色LED燈（相 當(dāng)于強(qiáng)光），和沒(méi)有開(kāi)白色LED燈（相當(dāng)于自然光條件下），以及黑暗條 件下中26C培養(yǎng)7天，觀察光生根繁殖情況，做記錄。表三實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄因素自然光白色光黑暗編號(hào)生根情況123金銀花 （根平均 生長(zhǎng)率/ 根平均長(zhǎng) 度

12、）71.2%/9.4mm60.8%/9.2mm60.2%/9.0mm梔于花 （根平均 生長(zhǎng)率/ 根平均長(zhǎng) 度）76.8%/10.2mm55.8%/10.0mm56.9%/10.0mm1.2.3還原糖的測(cè)定1.2.4.1實(shí)驗(yàn)原理還原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的單糖和某 些二糖（如乳糖和麥芽糖）。在堿性溶液中，還原糖能將Cu2+Hg2+, Fe3+、 Ag+等金屬離子還原，而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類(lèi)的這種性 質(zhì)常被用于糖的定性和定量測(cè)定。1.2.4.2費(fèi)林試劑：1.2.4.2.1試劑的組成甲液：稱(chēng)取15g硫酸銅（CuSO4.5H2O）及0.05g亞甲基藍(lán)，溶于蒸餾水中

13、并稀釋到1000ml。乙液：稱(chēng)取50g酒石酸鈉及75gNaOH，溶于蒸餾水中，再加入4&亞鐵氰化 鉀J中Fe(CN)6】，完全溶解后，用蒸餾水稀釋到1000M1，貯存于橡皮塞玻0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000g經(jīng)98100 C干燥至恒重的無(wú)水 葡萄糖，加蒸餾水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL濃HCL(防止微 生物生長(zhǎng))，蒸餾水稀釋到1000mL.6moI/LNCI:取250mL濃HCL(35%38%)用蒸餾水稀釋到500mL。碘-碘化鉀溶液：稱(chēng)取5g碘，10g碘化鉀溶于100mL蒸餾水中。費(fèi)林試劑由甲、乙兩種容易組成。甲液含硫酸銅和亞甲基藍(lán)(氧化 還原指示劑)；乙液含氫氧化

14、鈉，酒石酸鉀鈉和亞鐵氰化鉀。將一定量的甲液和乙液等體積混 合時(shí)，硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)，生成氫氧化銅沉淀： 2NaOH+CuSO=Cu(OH)+Na SO在堿性溶液中，所生成的氫氧化銅沉淀與酒4224石酸鈉反應(yīng)，生成可溶性的絡(luò)合物酒石酸鉀鈉銅：在加熱條件下，用樣液滴定，樣液中的還原糖于酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，酒 石酸鉀鈉銅被還原糖還原，產(chǎn)生紅色氧化亞銅沉淀，其反應(yīng)如下：反應(yīng)生成的氧化亞銅沉淀；與費(fèi)林試劑中的亞鐵氰化鉀(黃血鹽) 反應(yīng)生成可溶性復(fù)鹽，便于觀察滴定終點(diǎn)。Cu O+KFe(CN)+HOCu O+, 、, 、 、 , . 一2, 4_ 6 _ 、 . 2 _.K Fe(CN)+H OK Cu

15、Fe(CN)+2KOH滴定時(shí)以亞甲基藍(lán)氧化-還原指示劑。因462226.一為亞甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅離子全部被還原后，稍過(guò)量 的還原糖可使藍(lán)色的氧化型亞甲基藍(lán)還原為無(wú)色的還原型的亞甲基藍(lán)， 即達(dá)滴定終點(diǎn)。根據(jù)樣液量可計(jì)算出還原糖含量。1.2.4.2. 2器材試管3.0*20cm(*1);移液管5 ml(*1)；燒杯 100 ml(*1)； 250 ml錐 形瓶；調(diào)溫電爐；滴定管25ml(*1)1.2.4.2.3操作方法以樣品中還原糖的提取，準(zhǔn)確稱(chēng)取1g藥渣，放在100ml燒杯中，先 以少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入約40ml蒸餾水，混勻，于50 C恒溫 水浴中保溫20min,不時(shí)攪拌

16、，使還原糖侵出混。過(guò)濾，將濾液全部收集 在50m l的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。1.2.4.3樣品中總糖的水解及提取準(zhǔn)確稱(chēng)取1g藥渣，放在大試管中，加？6mol/LHCI10ml,蒸餾水15ml, 在沸水浴中加熱0.5h, 取出12滴置于白瓷板上，力皿滴I-KI溶液檢查水 解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解畢。冷卻至室溫后加 入1滴酚猷指示劑，以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到 100ml，過(guò)濾去濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀 釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測(cè)定。1.2.4.4空白滴定準(zhǔn)確吸取費(fèi)林試劑甲液和乙液

17、各5.00ml，置于250m 錐形瓶中，蒸 餾水10ml。從滴定管滴加約9ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加熱使其在2min內(nèi)沸 騰，準(zhǔn)確沸騰30s，趁熱以每2s1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直 至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積。平行 操作3次，取其平均值，按以下式計(jì)算：1.2.4.5樣品糖的定量測(cè)定（1）樣品溶液預(yù)測(cè)定:吸取費(fèi)林試劑甲液及乙液各5.00ml，置于250ml 錐形瓶中，加蒸餾水10ml，加熱使其在2.min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s,趁 熱以先快后慢的速度從滴定管中加樣品溶液，滴定時(shí)要保持溶液呈沸騰 狀態(tài)。待溶液由藍(lán)色變淺時(shí)，以每2，1滴的速度滴定，直至溶液的藍(lán)色

18、剛好褪去為終點(diǎn)。記錄樣品溶液消耗的體積。（2）樣品溶液測(cè)定：吸取費(fèi)林試劑甲液及乙液各5.00ml，置于錐形瓶 中，加蒸餾水10ml，加玻璃珠3粒，從滴定管中加入比與測(cè)試樣品溶液 消耗的總體積少1ml的樣品溶液，加熱使其在2min內(nèi)沸騰，準(zhǔn)確沸騰30s， 趁熱以每2s 1滴的速度繼續(xù)滴加樣液，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)。記錄 消耗樣品溶液的總體積。平行操作3次，取其平均值。編號(hào)123456789金銀花還原糖含 量（mg/ml）28.0%10.9%15.3%7.5%3.2%0.0%4.6%6.3%9.6%梔子花還原糖含 量（mg/ml）26.2%9.8%15.0%8.7%3.0%0.0%5.4%5.3

19、%15.6%3結(jié)論與討論3.1.0.不同外源激素對(duì)植物生根的影響:編號(hào)123456789金銀花生 根率/均 根長(zhǎng)71.2%/9.4m m34.5%/6.1m m45.6%/7.3m m15.6%/3.9m m9.0%/2.1 mm0.3%/0.1 mm13.6%/2.9m m17.3%/4.5m m26.6%/5.7m m梔子花生 根率/均 根長(zhǎng)76.8%/10.2 mm32.3%/5.3m m38.3%/8.0m m17.3%/4.6m m8.6%/3.5 mm0.0%/0.0 mm11.2%/3.8m m17.8%/5.5m m36.3%/6.3m m金銀花還原糖含量(mg/ml)28.0

20、%10.9%15.3%7.5%3.2%0.0%4.6%6.3%9.6%梔子花還原糖含量(mg/ml)26.2%9.8%15.0%8.7%3.0%0.0%5.4%5.3%15.6%結(jié)論：在離體組織培養(yǎng)過(guò)程中外源激6-BA： IBA： NAA=1： 2： 10的配 比下，青屬植物金銀花梔子花生根情況最后，還原糖含量最高。3.1.1.不同光質(zhì)對(duì)植物生根的影響：因素自然光白色光黑暗編號(hào)生根、情況、123金銀花71.2%/9.4mm60.8%/9.2mm60.2%/9.0mm梔子花76.8%/10.2mm55.8%/10.0mm56.9%/10.0mm結(jié)論：在離體組織培養(yǎng)過(guò)程中，光質(zhì)對(duì)青屬植物金銀4花，

21、梔子花的生長(zhǎng)繁殖情況不明顯。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)如上的數(shù)據(jù)，圖表可以看出，在離體條件下，外源激素對(duì)植株 生長(zhǎng)分化效果十分顯著，而光質(zhì)效果在短期來(lái)看無(wú)多大影響。光質(zhì)對(duì)細(xì) 胞的作用僅是一種誘導(dǎo)作用。光控制的形態(tài)建成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò) 程，不僅有光質(zhì)的影響，還有光強(qiáng)和光周期的影響。光質(zhì)的效應(yīng)不是簡(jiǎn) 單的相互疊加，而是相互影響的。在調(diào)節(jié)植物對(duì)光的反應(yīng)中起關(guān)鍵性用 的是光敏色素和隱花素。光質(zhì)通過(guò)這2種受體影響愈傷組織的誘導(dǎo)、分 化以及細(xì)胞內(nèi)含物的合成。植株生長(zhǎng)分化的環(huán)境是復(fù)雜多樣的，每一種 植物都有最適合其自身生長(zhǎng)發(fā)育的外界環(huán)境，單純研究光對(duì)植株的影響 沒(méi)有太大的價(jià)值，而必須與其他環(huán)境調(diào)控因子相結(jié)合

22、進(jìn)行研究。生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化的作用十分顯著，在研究過(guò)程中更應(yīng)把光 質(zhì)與其結(jié)合起來(lái)。目前光影響作物的很多生理生化機(jī)理還不十分清楚， 只有從分子水平進(jìn)行研究才能更好的對(duì)各種光質(zhì)加以利用。參考文獻(xiàn):1中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志：第5卷第2分冊(cè)M.北京：科學(xué)出版社，1999： 162. 25.2高新一，王玉英.植物無(wú)性繁殖實(shí)用技術(shù)M .北京：金盾出版社，2003： 391392，湯詩(shī)杰，李乃偉，湯庚國(guó).南京椴組織培養(yǎng)快繁體系的建立J.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(6)： 8789.劉芳.南京椴組織培養(yǎng)的研究D .南京：南京林業(yè)大學(xué)， 2007.周吉源，趙潔，楊和平，等.油菜薄層細(xì)胞培養(yǎng)中不同光質(zhì)對(duì)愈傷 組織誘導(dǎo)