1、不同核酸提取方法和儀器對(duì)熒光PCR定量結(jié)果的影響中國(guó)人民解放軍第三0二醫(yī)院王海濱寫(xiě)在課前的話熒光定量PCR質(zhì)量一般有三個(gè)要素,分別是試劑、儀器和人員,另外還有內(nèi)標(biāo)的影響。對(duì)熒光定量PCR的影響因素較多，因此要得出比較準(zhǔn)確、穩(wěn)定性的PCR結(jié)果，需要對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格控制。熒光定量PCR質(zhì)量的影響因素有哪些？一、熒光定量PCR質(zhì)量的三個(gè)要素?zé)晒舛縋CR質(zhì)量一般有三個(gè)要素，分別是試劑、儀器和人員。試劑是由生產(chǎn)廠家專門(mén)提供，包括核酸提取與擴(kuò)增兩個(gè)部分。核酸提取是由不同單位的工作人員進(jìn)行操作，擴(kuò)增部分是由廠家專門(mén)制備好的。儀器包括三個(gè)方面：溫控、光學(xué)和軟件，不同儀器溫控、光學(xué)、軟件三個(gè)部分原理和性能均

2、有一定差異。不同單位人員的專業(yè)知識(shí)和管理方式方法不同，對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有明顯的影響。另外還有內(nèi)標(biāo)的影響。熒光定量PCR質(zhì)量的影響因素皿)試劑儀器和人員內(nèi)標(biāo)以上均有正確答案：D與擴(kuò)增兩個(gè)部分，核酸提取是由不同單位的工作人員進(jìn)行操作，控、光學(xué)、軟件三個(gè)部分原理和性能均有一定差異。涉及環(huán)節(jié)較多。不同儀器溫不同單位人員的專業(yè)知識(shí)和管理方式方不同核酸提取方法對(duì)熒光PCR定量結(jié)果有何影響？法不同，對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有明顯的影響。二、不同核酸提取方法對(duì)熒光PCR定量結(jié)果的影響目前臨床常用的核酸提取方法有：一是聚乙二醇法，也稱煮沸法；二是層析柱法，也稱為提純法；第三是磁珠法，也稱吸附法。第四是近年出現(xiàn)的血清或血漿的檢測(cè)

3、標(biāo)本直接加入方法。第五是近年羅氏公司引進(jìn)的COBASTaqMan全自動(dòng)核酸提取與擴(kuò)增系統(tǒng)，其提取原理是磁珠法。（一）聚乙二醇法、操作步驟取100微升配置好的聚乙二醇工作液，需注意目前所用的聚乙二醇一般是20%的聚乙二醇，較黏稠，試劑盒保存溫度為-20度，因此在溫室要徹底的復(fù)溶，溶化呈液狀。加樣時(shí)吸100微升，因?yàn)轲こ恚欢ㄒ^(guò)吸、停頓，然后把吸頭外多余的聚乙二醇粘掉，再加到相應(yīng)的操作管中。吸和加均注意停頓，加入到操作管里面的含量應(yīng)該盡量精確至100微升。由于液體的黏稠，不同的人、不同的操作手法差異特別大。加好100微升的聚乙二醇后加入100微升待測(cè)標(biāo)本，主要包括血清、血漿或其他液體，二者要徹底

4、混勻。第二步是13000轉(zhuǎn)離心，一般用角度離心機(jī)離心10分鐘，棄掉上清液，盡可能少留殘余，并保證不把沉淀物吸掉，沉淀物含有核酸成分。第三步加入堿性裂解液25微升，堿性裂解液往往帶有懸浮物，充分混勻。含有核酸的沉淀物往往比較黏稠，加上堿性裂解液通過(guò)振蕩混勻常常不會(huì)把沉淀物振開(kāi)，而如果通過(guò)吹打混勻，又容易把沉淀物帶走一部分。此操作環(huán)節(jié)建議操作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失過(guò)多，而外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)又無(wú)變化，對(duì)結(jié)果的影響較大，是振蕩混勻或者吹打混勻，要求操作人員和廠家達(dá)成共識(shí)。最后一步是100度煮沸10分鐘，后13000轉(zhuǎn)離心10分鐘。取上清液進(jìn)行PCR檢測(cè)。、

5、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是操作較快速，可部分去除標(biāo)本中的PCR干擾物質(zhì)（膽紅素、血脂、離子等）。缺點(diǎn)是核酸丟失嚴(yán)重棄掉的上清液含有大量HBV（50%左右）；堿性裂解液核酸裂解不徹底，與混勻程度密切相關(guān)（丟失30%左右）。操作步驟較多,每個(gè)環(huán)節(jié)均存在不同實(shí)驗(yàn)室人員和儀器的差異，因此影響因素較多。（二）層析柱法1、操作步驟層析柱方法主要用于RNA的提取，以QIaGen試劑為例做簡(jiǎn)單的分析。它分為四個(gè)步驟：第一步是取560微升已配置好的核酸裂解液，與140微升待檢的標(biāo)本（血清、血漿或其他的液體）混勻，室溫靜置10分鐘。第二步加500微升的無(wú)水乙醇混勻，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘。第三步是層析柱過(guò)濾，將加過(guò)乙醇的標(biāo)本加到

6、層析柱，鐘，濾掉多余液體，核酸即可在層析柱上吸附，然后用洗滌液質(zhì)，13000轉(zhuǎn)高速離心2分鐘，將層析柱和層析膜上多余的物質(zhì)離下去，加50微升的洗脫液，室溫靜置10分鐘，讓它徹底溶在水中，脫液即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2、注意事項(xiàng)第一步核酸裂解液含有異硫氰酸胍或鹽酸胍，胍鹽是裂解核酸的物質(zhì)，它在低溫時(shí)容通過(guò)8000轉(zhuǎn)離心1分A和B洗脫柱上的鹽和蛋白在層析柱的中間10000轉(zhuǎn)離心3分鐘，洗易結(jié)晶、凝集，結(jié)晶后如果不能徹底溶化，只是取上清液和帶液標(biāo)本提取核酸，容易出現(xiàn)假陰性。通常的做法是在56度的環(huán)境讓核酸裂解液徹底溶化，以肉眼看不到結(jié)晶為標(biāo)準(zhǔn)。另外是在室溫靜置10分鐘，有的試劑盒是在72度放置10分鐘。

7、目前的核酸裂解液對(duì)病毒的裂解效果非常強(qiáng)，二者混勻之后，標(biāo)本中的核酸基本上在1到2分鐘均能夠徹底裂解，放置的時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)病毒裂解效果不再有意義，反而對(duì)標(biāo)本中的RNA起到降解作用。因此建議不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)摸索最佳條件。第三步是過(guò)層析柱，濾過(guò)后的液體，再進(jìn)行一次過(guò)濾，現(xiàn)層析柱過(guò)濾的東西含有近一半核酸，包括洗滌液A、洗滌液B洗滌下來(lái)的液體。第四步加50微升洗脫液尤為關(guān)鍵，洗脫液一定要加在層析柱的中間，讓它把層析膜完全浸泡，如果加在層析柱的壁上，而洗脫液沒(méi)有和承襲膜上的核酸進(jìn)行接觸，洗脫液不可能完全洗脫。每一個(gè)洗脫液均含有一定量的核酸，并且每次的丟失量幾乎在一半左右。、優(yōu)缺點(diǎn)此方法的優(yōu)點(diǎn)是可有效的去除標(biāo)本中

8、的PCR干擾物質(zhì)，如膽紅素、血脂、離子、蛋白、RNA酶等，提取的RNA的穩(wěn)定性比較好。缺點(diǎn)是核酸丟失比較嚴(yán)重，過(guò)濾丟失有50%左右，洗脫又接近50%。另外環(huán)境因素影響較大，如裂解液必須徹底的復(fù)溶，不能存在結(jié)晶、凝集，離心、操作、不同的實(shí)驗(yàn)室人員和儀器等的差異。（三）磁珠法1、操作步驟磁珠法為新興的方法。磁珠可以和磁吸附，因此可以省去離心過(guò)程，也有試劑仍采用離心的方法。以某公司試劑盒的HCV磁珠法為例做介紹：第一步，取100微升已經(jīng)配置好、含有磁珠的核酸裂解液，與100微升的待檢標(biāo)本（血清、血漿或者其他的體液），充分混勻，室溫靜置10分鐘，然后8000轉(zhuǎn)離心2分鐘，讓含有結(jié)合核酸的磁珠沉淀，去掉

9、上清液。第二步，加洗滌液和洗滌液B，分別用8000轉(zhuǎn)洗滌2分鐘，離心2分鐘，去掉上清液。最后一步有兩種做法，一種是把PCR反應(yīng)液直接加在含有磁珠的試管里，把磁珠溶開(kāi)，然后直接放置于PCR擴(kuò)增管里；第二種是把磁珠加洗脫液，將磁珠上的核酸洗脫下來(lái)，取上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失2、優(yōu)缺點(diǎn)作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失此

10、方法的優(yōu)點(diǎn)也是可有效去除PCR干擾物質(zhì)，其缺點(diǎn)為：磁珠棄上清和洗滌兩次去上清，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每次的上清都含有相應(yīng)的核酸；磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增有影響，洗脫的核酸丟失。如果把磁珠上的核酸洗脫下來(lái)，會(huì)產(chǎn)生洗脫不徹底的情況，洗脫應(yīng)盡可能在37度到50度的環(huán)境進(jìn)行，洗脫下來(lái)的核酸量較少。目前羅氏公司新出的MQ磁珠法提取核酸，洗脫時(shí)的環(huán)境溫度為50度。了108，因此不建議用此方法檢測(cè)病毒含量超過(guò)1.1D108的標(biāo)本。作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失（四）血清直接法1、操作步驟血清直接法是近年新出現(xiàn)的方法，目前市面上已有兩種方法。一種可稱為A法：取微升的核酸裂解液和微升

11、的待檢標(biāo)本（待檢標(biāo)本主要是血清、血漿或血細(xì)胞和其他體液，尿液或糞便不能用這種方法），二者混勻后直接加入PCR反應(yīng)液。第二種方法可稱為B法：取3pl核酸裂解液，與3pl待檢標(biāo)本（血清、血漿），混勻，95口處理10分鐘，直接加入PCR反應(yīng)液，13000RPM離心1分鐘直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。高溫處理10分鐘可以把標(biāo)本中的蛋白沉淀、凝固，沉淀核酸吸出。和A法不同的是它把蛋白做了沉淀凝固，相應(yīng)的減少了PCR干擾物質(zhì)。2、優(yōu)缺點(diǎn)此方法最重要的優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有核酸的丟失定量標(biāo)準(zhǔn)。B法經(jīng)過(guò)高溫處理后使蛋白發(fā)生了變形，在很大程度上消除了標(biāo)本中的干擾物質(zhì)。缺點(diǎn)是無(wú)法消除標(biāo)本中PCR干擾物質(zhì)帶來(lái)的干擾。A法目前在國(guó)內(nèi)已獲得

12、SDA批文，通過(guò)臨床檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床常規(guī)的大部分標(biāo)本影響不是很大，但是對(duì)病毒核酸比較低的標(biāo)本影響還是相對(duì)較大（五）COBASTaqMan全自動(dòng)核酸提取與擴(kuò)增系統(tǒng)最后一個(gè)方法是COBASTaqMan全自動(dòng)核酸提取與擴(kuò)增系統(tǒng)，為新進(jìn)入國(guó)內(nèi)的方法，為全自動(dòng)化設(shè)計(jì)的病毒載量平臺(tái)，具有sample-in,result-out的特點(diǎn)；內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品方法定量，保障結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度；實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中即可添加耗材、樣本及試劑，軟件可顯示所有內(nèi)容的進(jìn)行狀態(tài)；所有樣本,試劑及耗材采用條碼自動(dòng)掃描設(shè)計(jì),方便實(shí)驗(yàn)記錄及追蹤；整個(gè)試驗(yàn)流程應(yīng)最大程度避免污染問(wèn)題。分兩部分，第一部分是核酸提取系統(tǒng)，第二部分是擴(kuò)增系統(tǒng)。其特點(diǎn)為核酸

13、提取是全封閉的，一般需要2到3個(gè)小時(shí)，可以處理24或48個(gè)標(biāo)本，處理完以后直接把加好的PCR擴(kuò)增管移到擴(kuò)增儀器里，擴(kuò)增儀器有兩個(gè)擴(kuò)增裝置，可以單獨(dú)運(yùn)行。目前主要用于乙肝、丙肝、艾滋病毒的檢測(cè)。對(duì)乙肝的檢測(cè)范圍，敏感性可以達(dá)到12個(gè)IU每毫升，線性范圍是54到1.1D18。目前臨床標(biāo)本病人的血清病毒的含量均超過(guò)對(duì)丙肝低限可以達(dá)到15個(gè)IU，線性范圍是43到6.9D107。臨床研究發(fā)現(xiàn)，目作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失前丙肝病人血清或血漿中HCVRNA的含量基本上都涵蓋在此范圍之內(nèi)，因此丙肝病人不需要做稀釋和特殊選擇，HIV也是。綜上所述，把握核酸

14、提取的細(xì)節(jié)，對(duì)檢測(cè)的質(zhì)量非常重要，因此操作人員的專業(yè)素質(zhì)尤其重要。三、儀器對(duì)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的影響與熒光定量有關(guān)的環(huán)境因素，對(duì)于儀器包括三個(gè)部分，第一個(gè)熱模塊。熱模塊的原理不同，會(huì)導(dǎo)致溫度均一性。目前PCR儀器的熱模塊主要包括半導(dǎo)體、空氣和壓縮機(jī)，空氣加熱相對(duì)比較穩(wěn)定和快速，均一性相對(duì)較好。第二個(gè)是光學(xué)模塊，即熒光的采集、照相部分。目前大部分儀器是采用CCD照相的原理、PMT逐行掃描和光柵的逐孔，其中PMT逐行掃描的均一性較好，CCD照相的差異相對(duì)較明顯。第三個(gè)是軟件模塊，一般的影響因素較小，但是有的軟件可以有效捕捉到PCR擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增的點(diǎn)和有效的放大倍數(shù)，此倍增的處理能夠有效的反應(yīng)擴(kuò)增量的

15、變化。因此軟件模塊對(duì)結(jié)果分析的簡(jiǎn)易程度也有一定影響。不同的儀器的差異或同一個(gè)儀器均一性的實(shí)驗(yàn)常選擇5點(diǎn)平均分布的方法。如96孔板，開(kāi)在96孔板的4個(gè)角和中間，加上通往復(fù)孔的3到4份標(biāo)本（同一個(gè)核酸含量），然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，看五個(gè)區(qū)域的結(jié)果是否能夠在有效的的質(zhì)控范圍之內(nèi)，即為5點(diǎn)平均分布。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)不同的儀器甚至同類型的儀器存在差異。因此在選擇儀器時(shí)要考慮究竟是應(yīng)用于科研還是臨床常規(guī)檢測(cè)，用于科研影響不是很大，但臨床檢驗(yàn)需對(duì)儀器間的差異做校準(zhǔn)。作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失圖1理想化的擴(kuò)增曲線都應(yīng)該在按照相應(yīng)指數(shù)擴(kuò)增圖1為理想化的擴(kuò)增曲線。

16、不論標(biāo)本中的核酸含量高低，速度向上擴(kuò)增，溫控、光學(xué)、軟件模塊都應(yīng)該達(dá)到同樣的標(biāo)準(zhǔn)和理論值，和實(shí)體一致。理論值和實(shí)體值要一致，才能達(dá)到比較標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果。圖2擴(kuò)增圖圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4中高拷貝的和低拷貝的平行，它的擴(kuò)增效果和倍增均一致。圖5有線的交叉，即存在孔間和擴(kuò)增效率的不一致，對(duì)定性實(shí)驗(yàn)影響不大，但對(duì)定量實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生一定影響。作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失圖4平行曲線圖5交叉曲線四、內(nèi)標(biāo)與內(nèi)標(biāo)定

17、量對(duì)熒光定量的影響作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失提出內(nèi)標(biāo)目的是避免假陽(yáng)性。內(nèi)標(biāo)有兩種，一種是監(jiān)控核酸的提取，另一個(gè)是內(nèi)標(biāo)定（四）內(nèi)標(biāo)定量的誤差（以COBASTaqMan為例）作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失提出內(nèi)標(biāo)目的是避免假陽(yáng)性。內(nèi)標(biāo)有兩種，一種是監(jiān)控核酸的提取，另一個(gè)是內(nèi)標(biāo)定（四）內(nèi)標(biāo)定量的誤差（以COB

18、ASTaqMan為例）作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失量。實(shí)時(shí)熒光PCR不需要內(nèi)標(biāo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。1、Ct值的重現(xiàn)性：PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。2、Ct值與起始模板的線性關(guān)系：由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲

19、線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)本同步進(jìn)行核酸提取的曲線定量方法。（二）內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。正因如此，定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，仍為一種半定量方法。美國(guó)Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種

20、準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。圖6可看到內(nèi)標(biāo)在高拷貝時(shí)比較低。如果標(biāo)本含量比較低，內(nèi)標(biāo)是5，標(biāo)本里含量3是10，內(nèi)標(biāo)會(huì)把標(biāo)本曲線壓的比較低，出現(xiàn)偏差，甚至出現(xiàn)假陰性。2（三）內(nèi)標(biāo)的失敗率對(duì)采用3家公司考核試劑內(nèi)標(biāo)失敗率分析結(jié)果顯示，3家試劑的內(nèi)標(biāo)均存在內(nèi)標(biāo)失敗的情況，但各不相同，陽(yáng)性標(biāo)本的失敗率在3.2%-16.5%，陰性樣本的內(nèi)標(biāo)失敗率在4%-7.2%，高于COBAS的失敗率（1.7%，1/60）。摻入內(nèi)標(biāo)的量大多為5D103左右，采用PEG和直接加入兩種方法對(duì)2D103的HBV陽(yáng)性血清進(jìn)行96孔重復(fù)核酸提取，敗率均為作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸

21、丟失統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照的內(nèi)標(biāo)值（HBV定量檢測(cè)）為29.10.4，即如果沒(méi)有標(biāo)作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失本中的核酸干擾，這些內(nèi)標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，它的Ct值是29.1。隨著標(biāo)本中的核酸含量升高，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。當(dāng)標(biāo)本中的核酸是12.1-5IU/ML，內(nèi)標(biāo)值是29.00.8，基本作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失上內(nèi)標(biāo)和陰性對(duì)照相似。此含量的標(biāo)本不會(huì)對(duì)內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生明顯競(jìng)爭(zhēng)。5D103-5D103IU/ML范圍內(nèi)標(biāo)本的內(nèi)標(biāo)值為28.21.6，內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)上移。5D10-1D108IU/M、1D作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失作人員咨詢實(shí)際生產(chǎn)廠家，因?yàn)樵噭┖袠?biāo)準(zhǔn)品不通過(guò)核酸提取，如果這一步標(biāo)本的核酸丟失27.12.9和31.4S.008.00006001.00J.0000too0.00OW)00006WSOTJ.M00育內(nèi)廡有內(nèi)蘇S.002.00O.CQ部分比較多，因此要得出比較準(zhǔn)確、穩(wěn)定性的