1、分子流行病學(xué)應(yīng)用實(shí)習(xí)16流行病學(xué)教研室實(shí)習(xí)要點(diǎn)單元1 分子流行病學(xué)的發(fā)展歷史單元2 分子流行病學(xué)常用檢測(cè)方法單元3 課題討論實(shí)習(xí)要點(diǎn)單元1 分子流行病學(xué)的發(fā)展歷史單元2 分子流行病學(xué)常用檢測(cè)方法單元3 課題討論一、分子流行病學(xué)產(chǎn)生的背景 分子流行病學(xué)(molecular epidemiology)是近十幾年才迅速發(fā)展起來的一門流行病學(xué)新分支，它是由傳統(tǒng)流行病學(xué)學(xué)科發(fā)展的強(qiáng)烈需求和分子生物學(xué)理論和技術(shù)取得的巨大成就相結(jié)合的產(chǎn)物。分子生物學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展1953 - Discovery of DNA double helix (Crick & Watson)1960s - DNA trans

2、cription mechanism1972 - Recombinant DNA technology1985 - PCR (Kary Mullis)1990s - Human Genome Project2000s - Human Haplotype Project 6(一)疾病預(yù)防控制中的需求傳染性疾病 耐藥性質(zhì)粒；病原體變異；新發(fā)現(xiàn)傳染病。 慢性非傳染病 多病因、多階段、多基因、長(zhǎng)潛隱期。人群易感性 生物個(gè)體間的遺傳和環(huán)境不同，易感性差異很大；傳統(tǒng)流行病學(xué)無法有效測(cè)量。實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué) 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的病因假設(shè)和防治措施的人群檢驗(yàn)。(二)分子生物學(xué)的快速發(fā)展理論的突破 如：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，遺傳中心法

3、則，遺傳密碼子，RNA逆轉(zhuǎn)錄，斷裂基因，操縱子模型，限制性內(nèi)切酶，DNA聚合酶，DNA連結(jié)酶，染色體外遺傳物質(zhì)等。技術(shù)的創(chuàng)新 凝膠電泳技術(shù)，核酸體外擴(kuò)增，DNA測(cè)序，蛋白質(zhì)測(cè)序，分子雜交，基因克隆，色譜技術(shù)，計(jì)算機(jī)應(yīng)用。人類基因組計(jì)劃1990年啟動(dòng)，2003年發(fā)表完整的基因序列圖9二 分子流行病學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展概念的演變定義分子流行病學(xué)的發(fā)展(一)概念的演變 國(guó)外：1972年-提出“流感分子流行病學(xué)”1993年：美國(guó)Schulte出版了世界上第一本分子流行病學(xué)專著分子流行病學(xué)-原理和實(shí)踐 (Molecular Epidemiology: Principles and Practice)。1996

4、年國(guó)際流行病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議：狹義分子流行病學(xué)是測(cè)量作為暴露或效應(yīng)的生物標(biāo)志信息大分子：DNA、RNA和蛋白質(zhì)。從廣義上包括任何實(shí)驗(yàn)的、生化的測(cè)量。11國(guó)內(nèi)：1988年：分子生物學(xué)理論和技術(shù)應(yīng)用于流行病學(xué)的邊緣學(xué)科，主要是通過對(duì)造成某一疾病流行的病原體，在基因水平上分析其特征，從而更準(zhǔn)確地解決傳染源和傳播途徑等有關(guān)流行病學(xué)問題。1992年：利用分子生物學(xué)原理和技術(shù)，從分子乃至基因水平上研究醫(yī)學(xué)事件在人群和環(huán)境生物群眾的分布及其決定因素和調(diào)控手段的學(xué)科。 (二)定義 分子流行病學(xué) 是闡明人群和醫(yī)學(xué)相關(guān)生物群體中生物標(biāo)志的分布及其與疾病/健康的關(guān)系和影響因素，并研究防治疾病、促進(jìn)健康的策略與措施的科學(xué)。

5、 生物標(biāo)志（biological marker，biomarker，簡(jiǎn)稱M） 指能代表生物結(jié)構(gòu)和功能的可識(shí)別物質(zhì)。分子事件（molecular event）或分子生物標(biāo)志（molecular biomarker）主要指代表生物結(jié)構(gòu)和功能的生物大分子特征。如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等。將分子生物學(xué)理論和方法應(yīng)用于流行病學(xué)研究的學(xué)問。(上世紀(jì)80年代）闡明疾病和健康狀態(tài)相關(guān)生物標(biāo)志(或分子事件)在人群和生物群體中的分布及其影響因素,并研究防治疾病、促進(jìn)健康的策略和措施的科學(xué)。（第四版）闡明人群和醫(yī)學(xué)相關(guān)生物群體中生物標(biāo)志的分布及其與疾病/健康的關(guān)系和影響因素，并研究防治疾病、促進(jìn)健康的策略與措施的科

6、學(xué)。（第五版） 分子流行病學(xué)是流行病學(xué)的一個(gè)分支(分子生物學(xué)？群體遺傳學(xué)？)分子流行病學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容是各種生物標(biāo)志物及相關(guān)過程分子流行病學(xué)的研究方法是隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展不斷更新的幾個(gè)要點(diǎn)：15 與傳統(tǒng)流行病學(xué)不同 與分子生物學(xué)不同 與群體遺傳學(xué)不同 宏觀與微觀相結(jié)合的人群研究！16特點(diǎn)傳統(tǒng)流行病學(xué)暴露疾病 ？ 前瞻性研究回顧性研究分子流行病學(xué)傳統(tǒng)流行病學(xué)與分子流行病學(xué)的關(guān)系（EDC模型）（Schulte,1993）暴露疾病17A 暴露 疾病 易感性分子流行病學(xué)B 暴露內(nèi)暴露早期生物學(xué)效應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能變異臨床疾病 易感性 暴露內(nèi)暴露早期生物學(xué)效應(yīng)續(xù)發(fā)生物學(xué)效應(yīng)健康狀態(tài) 易感性傳統(tǒng)流行病學(xué)三、常

7、用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)核酸技術(shù)（DNA & RNA）核酸體外擴(kuò)增 （PCR）核酸電泳圖譜 核酸酶切電泳圖譜 （RFLP）核酸分子雜交 有原位雜交、斑點(diǎn)雜交、轉(zhuǎn)印雜交（包括Southern blot檢測(cè)DNA和Northern blot檢測(cè)RNA）等。核酸序列分析蛋白質(zhì)技術(shù) 蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)主要有：電泳、凝膠電泳、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印雜交（Western blot）、色譜分析、蛋白質(zhì)測(cè)序等。酶學(xué)技術(shù) 包括定性和定量檢測(cè)，要求一定的條件。多位點(diǎn)酶電泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE）法。其它技術(shù) 免疫學(xué)技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光免疫試驗(yàn)（FIA）、

8、放射免疫試驗(yàn)（RIA）、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)（ICC）等； 色譜技術(shù)：高效液相色譜技術(shù)HPLC）、液相蛋白色譜技術(shù)（FPLC）等。19核酸技術(shù) 核酸電泳圖譜 核酸酶切電泳圖譜 核酸分子雜交 核酸體外擴(kuò)增 核酸序列分析 蛋白質(zhì)技術(shù) 凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)印雜交、蛋白質(zhì)測(cè)序酶學(xué)技術(shù) 多位點(diǎn)酶電泳法 生物芯片技術(shù) 基因芯片 其他技術(shù) 免疫學(xué)技術(shù) 如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光免疫試驗(yàn)(FIA) 等；色譜技術(shù) 如高效液相色譜技術(shù)(HPLC)等Automated Liquid HandlerSpectroPREPTMNanoliter DispenserSpectroJETTMMALDI-TOF Mass

9、 SpectrometerSpectroREADERTMAutomated AnalysisSpectroTYPERTMMiniaturized BiochipSpectroCHIPTMMassARRAYIntegrated Components21實(shí)驗(yàn)室中的質(zhì)量控制1一般實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 (1)標(biāo)本采集和儲(chǔ)存 (2)試劑和材料 (3)儀器 (4)實(shí)驗(yàn)方法 (5)操作規(guī)范2設(shè)立多重對(duì)照 為保證檢測(cè)質(zhì)量，可以設(shè)立多種對(duì)照，而且可以采取“盲法”。 (1)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照 (2)空白對(duì)照 (3)重復(fù)對(duì)照3重復(fù)試驗(yàn) (1)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù)試驗(yàn) (2)實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)試驗(yàn)22測(cè)量指標(biāo)的選擇的原則生物標(biāo)志應(yīng)特異、穩(wěn)定標(biāo)本采集

10、、儲(chǔ)存方便檢測(cè)方法比較簡(jiǎn)單、實(shí)用，而且操作規(guī)范，便于 與同類研究結(jié)果比較檢測(cè)方法靈敏度和特異度高 分子流行病學(xué)研究成功的關(guān)鍵在采集和儲(chǔ)存過程中不能受到“污染” 儲(chǔ)存的生物標(biāo)本在任何時(shí)候進(jìn)行檢測(cè)都可以獲得一致的結(jié)果所有的生物標(biāo)本都應(yīng)有詳細(xì)的背景材料和鑒別標(biāo)識(shí)實(shí)例分析研究實(shí)例 1研究題目 波蘭某工業(yè)區(qū)環(huán)境中芳香族化合物暴露人群的DNA加合物研究測(cè)量指標(biāo) DNA加合物/淋巴細(xì)胞DNA（介質(zhì)）測(cè)量方法 熒光檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法、DNA加合物32P后標(biāo)記技術(shù)研究設(shè)計(jì) 橫斷面分析研究 暴露組 煤焦油作業(yè)工人 對(duì)照組 當(dāng)?shù)爻鞘芯用?、近郊農(nóng)民 排除年齡、吸煙、其他職業(yè)暴露等因素影響 比較3組DNA加合物水平結(jié)

11、果分析 當(dāng)?shù)爻鞘芯用瘢?9例）與煤焦瀝青作業(yè)工人（63例）的DNA加合物水平和譜型相似 近郊農(nóng)民（15例）的DNA加合物水平僅為煤焦油作業(yè)工人的1/2或1/3 結(jié)論 環(huán)境中芳香族化合物（煤焦油）暴露可導(dǎo)致體內(nèi)DNA加合物水平質(zhì)量控制 每份標(biāo)本同時(shí)在不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 結(jié)果一致性好(r=0.66, p0.01)研究實(shí)例 2研究題目 應(yīng)用HBV-DNA序列多態(tài)性研究HBV的傳播測(cè)量標(biāo)志 HBV 2551-2650位點(diǎn)核酸序列/血清HBV-DNA 測(cè)量方法 ELISA法和PCR法 研究設(shè)計(jì) 類病例對(duì)照研究（病例病例研究） 96名HBeAg陽性兒童和用ELISA檢測(cè)HBV血清陽性的97名父母 假設(shè)該位點(diǎn)核

12、酸序列在兒童與父母之間分配是隨機(jī)的結(jié)果分析 該序列在兒童和父母之間是非隨機(jī)分配的（P0.00005) 結(jié)論 HBV具有家庭內(nèi)傳播質(zhì)量控制 關(guān)于家庭成員之間1%的序列差異的解釋 排除了PCR錯(cuò)配可能研究實(shí)例 3研究目的 應(yīng)用PCR測(cè)序追蹤HIV傳染源 測(cè)量指標(biāo) HIV/外周血單核細(xì)胞（介質(zhì)） 測(cè)量方法 PCR和核酸測(cè)序 研究設(shè)計(jì) 橫斷面調(diào)查：1名牙科醫(yī)生（HIV攜帶者，可疑傳染源），7名HIV感染者（都曾接受該牙醫(yī)的治療）；35名當(dāng)?shù)嘏c牙醫(yī)無關(guān)的HIV感染者。比較這些HIV毒株之間的關(guān)系。 結(jié)果分析 牙醫(yī)的HIV株與其曾治療的5名病人的HIV株具有克隆關(guān)系，而與其他毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)論：牙醫(yī)是

13、其曾治療的5名病人的HIV的傳染源。四、 應(yīng)用前景 傳染病預(yù)防控制 慢性非傳染病預(yù)防控制 健康狀態(tài)研究 傳染病預(yù)防控制 病原體耐藥、新病原體的出現(xiàn)、病原體變異、發(fā)病譜的變化、傳染源的判定、傳播途徑復(fù)雜化、疫苗免疫效果下降等，大多需要應(yīng)用分子流行病學(xué)來解決。病原體研究人群感染和傳染源研究 傳播途徑研究人群易感性研究疫苗及免疫預(yù)防制劑的研究防治對(duì)策和措施研究及其效果評(píng)價(jià) 慢性非傳染病預(yù)防控制 暴露測(cè)量更加科學(xué)、準(zhǔn)確；如將暴露測(cè)量分為外暴露、內(nèi)暴露、生物作用劑量等；細(xì)微效應(yīng)可以察覺，可以測(cè)定健康疾病連續(xù)帶不同階段的效應(yīng)指標(biāo)；易感性研究深入到基因和分子水平；防治措施效果評(píng)價(jià)更加有效。 健康狀態(tài)研究 以生物標(biāo)志為基礎(chǔ)的健康狀態(tài)分布及其影響因素研