1、實(shí)時熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司20 August 2022主 要 內(nèi) 容Real Time PCR基礎(chǔ)知識12Real Time PCR實(shí)驗(yàn)方法3Real Time PCR解析方法4Real Time PCR應(yīng)用實(shí)例Real Time PCR基礎(chǔ)知識1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的檢測方法Real Time PCR基礎(chǔ)知識1Real Time PCR的用途Real Time PCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌

2、檢測物種鑒定基因分型絕對定量相對定量Real Time PCR的原理 激發(fā)光發(fā)射光使用Real Time PCR擴(kuò)增裝置實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。Real Time PCRCt值Real Time PCR基礎(chǔ)知識1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的檢測方法Real Time PCR基礎(chǔ)知識1TaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBR Green I熒光染料嵌合法熒光探針法Real Time PCR的檢測方法熒光染料嵌合法（SYBR Green I）SYBR Green I：是一種能結(jié)合于所

3、有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的 具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBR Green IPrimer退 火 FFFFSYBR Green I 法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延 伸 FFFFFFPrimer熱變性 FFFFTaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5 端標(biāo)記一個報(bào)告基團(tuán)（Reporter），3 端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（Quencher）。 RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性 退 火 延 伸 TaqMan Probe法原理示意圖 One-Step RT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計(jì)要求高 Probe法 Probe合成

4、費(fèi)用高SYBR Green I 法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBR Green I 法 簡便易行價(jià)格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測主 要 內(nèi) 容2Real Time PCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Real Time PCR反應(yīng)RT Primer的選擇 Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific PrimerOligo dT PrimerPCR R-PrimerPCR F-Primer目的片段在距Poly(A) Tail

5、1.5 kbp 以內(nèi)適用，RT效率較高。One Step RT-PCR 只能使用Gene Specific Primer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。53Gene Specific Primer目的片段RFAAA53目的片段RF1,500 baseOligo dT PrimerRandom目的片段53RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達(dá)量分析最適。Oligo dT Primer53RFAAA目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RT Primer的選擇Real Time PCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的

6、是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。Real Time PCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同= 對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通PCR引物Real Time PCR引物兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值 Tm值40-60%(最好45-55%) GC含量Primer長度80-150 bp(盡量限制在300 bp以內(nèi))擴(kuò)增片段大小17-25 base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 特異性 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3 base以上的互補(bǔ)序列 引物3 末端避免2 base以上的互補(bǔ)序列 互補(bǔ)性3 末端序列 整體上堿基不能過偏 個別部分避免GC rich或A

7、T rich(特別是3 端) 避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)序列 3 末端避免GC rich或AT rich 3 末端堿基最好為G 或C 3 末端堿基盡量避免為T盡量在Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增 RT-PCR用引物Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則探針的Tm比引物高8-10 Tm值20-24 bp Probe長度探針5 末端的第一個堿基不能是G5 末端序列 目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計(jì) 整體上堿基不能過偏 個別部分避免GC rich或AT rich (特別是3 端)；避免T/C 連續(xù)，A/C連續(xù)序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3 base以

8、上的互補(bǔ)序列 互補(bǔ)性BLAST檢索確認(rèn)Probe特異性 特異性Real Time PCR用TaqMan探針設(shè)計(jì)原則Real Time PCR探針設(shè)計(jì)原則線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。No Template Control確認(rèn)30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應(yīng)性能確認(rèn)主 要 內(nèi) 容3Real Time PCR解析方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2. 融解曲線分析3. 絕對定量和相對定量解析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯

9、度的選擇：56個梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為10105 104 103 102 101 100 105 104 103 102 101 100標(biāo)準(zhǔn)品的種類 基因組DNA 質(zhì)粒 Total RNA & cDNA 體外轉(zhuǎn)錄RNADNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品 RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取，OD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至105-101 copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RNA梯度稀釋至105-101 copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。T7 RNA polymerase

10、體外轉(zhuǎn)錄RNATotal RNAPCRcDNARTT7 PromoterTTTTTPCR產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因AAAAAAAAAA理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整Negative Control為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺區(qū)匯于一起線性范圍寬理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線 相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。 擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。 擴(kuò)增效率 相關(guān)系數(shù) 擴(kuò)增效率（E）計(jì)算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示起始模板濃度（log10)，Y軸表示Ct值時 E=10-1/a-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示Ct值，Y軸表示起始模板濃度（log10) E=10-a-1 Real Time

11、 PCR解析方法3Real Time PCR解析方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2. 融解曲線分析3. 絕對定量和相對定量解析方法融解曲線分析 Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時的溫度。 SYBR Green I 法進(jìn)行檢出時，要根據(jù)融解曲線確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解曲線分析3Real Time PCR解析方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2. 融解曲線分析3. 絕對定量和相對定量解析方法Real Time PCR解析方法絕對定量解析方法提取樣品引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品制備Real Time PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)分析流程絕對定量解析方法通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷

12、貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。105104103101擴(kuò)增曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 檢測樣品檢測樣品102相對定量解析方法以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。Sample BSample A目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同進(jìn)行相對表達(dá)量分析必要性實(shí)際上目的基因表達(dá)量分析相對定量解析方法管家基因 維持細(xì)胞基本代謝活動所必須的基因, 如：GAPDH、-actin等。篩選方法 根據(jù)文獻(xiàn)提供 通過具體實(shí)驗(yàn)篩選主 要 內(nèi) 容Real Time PCR基礎(chǔ)知識12Real Time PCR實(shí)驗(yàn)方法3R

13、eal Time PCR解析方法4Real Time PCR應(yīng)用實(shí)例 對SARS病毒基因進(jìn)行定量分析絕對定量相對定量 分析小鼠PAH基因在不同組織中的表達(dá)量變化絕對定量應(yīng)用例 對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量 檢測方法 TaqMan probe 法 檢測樣品 3個從SARS樣品中提取的Total RNA 目的基因 SARS病毒RNA 內(nèi) 參 SARS Internal Control RNA 標(biāo) 準(zhǔn) 品 SARS Control RNA 試 劑 One Step PrimeScript RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（DRR064） 儀 器 Smar

14、t Cycler SYN247 F02SYN247R03SYN247 F01SYN247R02SYN247R01SYN247 F01BamH Hind pBluescript II SK(+) VectorT7 PromoterBamH Hind Sac site SARS Control RNA構(gòu)建絕對定量應(yīng)用例 對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量 純化的SARS Control RNA OD值測定結(jié)果 體外轉(zhuǎn)錄的SARS Control RNA 電泳照片M1 M2M1: -Hind digest M2: DL2,000 MarkerDNase I處理前DNase I處理后絕對

15、定量應(yīng)用例 對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量DNA BNITMSARAs2 Adaptor R Sacsite Bam Hsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 PromoterSARS Internal Control RNA的構(gòu)建AApBluescriptII SK(+) Vector 絕對定量應(yīng)用例 對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量探針的選擇 TemplatePrimerTaqMan Probe5 端報(bào)告基團(tuán)3 端淬滅基團(tuán)SARS Control RNAor SARS Genomic RNA共用FAM標(biāo)記Eclipse標(biāo)記SARS Inter

16、nal Control RNA共用ROX標(biāo)記Eclipse標(biāo)記絕對定量應(yīng)用例 對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量SARS Control RNA 105-101擴(kuò)增曲線 SARS Genomic RNA Sample 1、擴(kuò)增曲線 SARS Internal Control RNA擴(kuò)增曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線 絕對定量應(yīng)用例 對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量定量結(jié)果對三個樣品所含SARS病毒RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。絕對定量應(yīng)用例 對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況檢測方法 SYBR Green I 熒光嵌合法

17、管家基因 GAPDH基因目的基因 PAH基因標(biāo) 準(zhǔn) 品 cDNA試 劑 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （DRR047） SYBR Premix Ex TaqTM II (Tli RNase H Plus) （DRR820）儀 器 Thermal Cycler Dice Real Time System （TP800） Total RNA提取Total RNA基因組DNA去除標(biāo)準(zhǔn)品RNA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及預(yù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)資料獲取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及引物 設(shè)計(jì)、合成樣品Real Time PCR反應(yīng)相對定量計(jì)算及數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)整理及論文撰寫相對定量應(yīng)用

18、例 分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況提取Total RNA后電泳照片提取試劑：TaKaRa RNAiso Plus （ D9108 ）相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況M C L B M M：DL2,000 DNA MarkerC：Control RNAL：Liver RNAB：Brain RNA目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果擴(kuò)增曲線圖融解曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖管家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況擴(kuò)增曲線圖樣品目的基因定量結(jié)果樣品管家基因定量結(jié)果管家基因 GAPDH目的基因 PAH定量結(jié)果平均值定量結(jié)果平均值通過GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝臟和腦中PAH的相對表達(dá)量樣品a12288002221751966002011750.905 3757 212700204400樣品a2227300207100219900196600樣品 b133360034097576.80 82.182.4110-4134030092.65 樣品 b235410082.46 33590076.80 相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況 通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算得出，苯丙氨酸