1、.：.；細(xì)菌種特異性的S rDNA寡核苷酸探針數(shù)據(jù)庫的初步構(gòu)建蔡正求首都師范大學(xué)生物系，北京 摘要：核酸二級數(shù)據(jù)庫是生物信息學(xué)研討的重要領(lǐng)域，對生命科學(xué)的研討和開展起重要作用。目前，國際核酸序列公共數(shù)據(jù)庫中存在大量的細(xì)菌S rDNA序列，本文將利用這些知細(xì)菌的S rDNA序列，設(shè)計(jì)細(xì)菌種的特異性寡核苷酸探針，將其結(jié)果存入數(shù)據(jù)庫，以計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)為載體，開發(fā)界面友好的經(jīng)過WWW 閱讀器實(shí)現(xiàn)對數(shù)據(jù)庫查詢的系統(tǒng)，查詢結(jié)果籠統(tǒng)直觀，為設(shè)計(jì)細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針提供參考和協(xié)助 ，從而可加速對細(xì)菌分類及鑒定的進(jìn)程。關(guān)鍵詞：細(xì)菌 種特異性 S rDNA 寡核苷酸探針 二級數(shù)據(jù)庫CONSTRUCTION DA

2、TABASE OF SPECIES-SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE PROBES TARGETED FOR S rDNA OF BACTERIAAbstract: Secondary database that play an important role in the research and development of biology is a vital research subject in the field of bioinformatics. At present,there are enormous S rDNA sequences of bacteria

3、available in the Genbank. In that paper the species-specific oligonucleotide probes for various bacteria according to S rDNA have been designed and stored into database. And an user-friendly search system based on computer network has been constructed. that secondary database could help users to des

4、ign oligonucleotide probes to classify and identify bacteria.Key works: Bacteria，Species-specific, S rDNA, Oligonucleotide probe, Secondary database生物信息學(xué)是近年來生物學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息學(xué)及運(yùn)用數(shù)學(xué)交叉交融而衍生出的新興邊緣學(xué)科。隨著人類基因組方案等大型國際工程的實(shí)施, 分子生物信息的研討開發(fā)和運(yùn)用曾經(jīng)成為當(dāng)前一個(gè)前沿領(lǐng)域和研討熱點(diǎn)。DNA 序列測定技術(shù)的完善和運(yùn)用, 使核酸序列數(shù)據(jù)庫迅速增長。國際上著名的三大核酸序列數(shù)據(jù)庫EMBL, GenB

5、ank 和DDBJ 的數(shù)據(jù)量以指數(shù)曲線增長，并為其他生物學(xué)數(shù)據(jù)庫的建立提供了豐富完善的資源。但這些數(shù)據(jù)庫提供的僅僅是未加工的原始數(shù)據(jù)，他們稱之為一級數(shù)據(jù)庫。這些一級數(shù)據(jù)庫中存在大量的冗余信息，用于處理特殊生物學(xué)問題的信息越來越難提取。二級數(shù)據(jù)庫是根據(jù)研討義務(wù)的需求，經(jīng)過搜索、查詢知數(shù)據(jù)庫的信息進(jìn)展加工整理，構(gòu)建公用的數(shù)據(jù)庫。以一級數(shù)據(jù)庫為根底，將它們按照不同運(yùn)用者的要求，采用計(jì)算機(jī)技術(shù)，歸納、提煉、整理、加工和構(gòu)建具有特殊生物學(xué)意義和專門用途的二級數(shù)據(jù)庫對于生物學(xué)研討意義更大。rDNA分子在生物體中普遍存在，生物細(xì)胞rDNA分子的一級構(gòu)造中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列。保守的片段反響

6、了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變片段那么能闡明物種間的差別，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列那么是不同分類級別生物如科、屬、種鑒定的分子根底。因此可根據(jù)rDNA序列設(shè)計(jì)用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物的檢測或鑒定的探針。近幾年來，以S rDNA為靶分子的PCR引物或雜交探針已用于很多細(xì)菌的快速鑒定，它已成為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析及鑒定的最有效和最常用的分子目的。隨著計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的迅速開展, 很多分子生物數(shù)據(jù)庫提供網(wǎng)上查詢效力。目前網(wǎng)上分子生物信息數(shù)據(jù)庫的總數(shù)已達(dá) 多個(gè)。有關(guān)寡核苷酸探針的專門數(shù)據(jù)庫有兩個(gè)，分別是Michigan State University的寡核苷酸探針數(shù)據(jù)庫 HYP

7、ERLINK /OPD/ /OPD/和Ribosomal Database ProjectRDP數(shù)據(jù)庫/html/這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫在運(yùn)用分子生物學(xué)領(lǐng)域提供設(shè)計(jì)和運(yùn)用寡核苷酸探針的資料和核糖體相關(guān)的數(shù)據(jù)效力，包括在線數(shù)據(jù)分析，基于rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建以及陳列和注釋rRNA序列。但國內(nèi)外還沒有提供細(xì)菌種的特異性寡核苷酸探針及其設(shè)計(jì)的專門數(shù)據(jù)庫。 資料和方法. 預(yù)備數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)開發(fā)環(huán)境采用基于PC/Linux的數(shù)據(jù)庫及程序開發(fā)環(huán)境，在PC機(jī)上安裝Linux操作系統(tǒng)及其它一些軟件。PC機(jī)為方正電腦，其配置為Intel CPU.GHz/內(nèi)存MB/G IDE硬盤。操作系統(tǒng)采用RedHat Linux.，數(shù)

8、據(jù)庫管理系統(tǒng)運(yùn)用MySQL，編程言語采用Perl和HTML，Web開發(fā)軟件為dreamweaver。. 數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建數(shù)據(jù)庫總體上是基于關(guān)系數(shù)據(jù)庫方式構(gòu)建，共包括細(xì)菌稱號表mainprobe、部分序列陳列表Partial_seq_align和無種特異性的S rDNA寡核苷酸探針的細(xì)菌稱號表nonprobe。細(xì)菌稱號表包含細(xì)菌稱號Bacname，細(xì)菌的特異性寡核苷酸序列Probe sequences和編號ID。部分序列陳列表包含細(xì)菌的編號ID和其特異性寡核苷酸序列所對應(yīng)的部分序列陳列結(jié)果Partial_seq_align。無種特異性的S rDNA寡核苷酸探針的細(xì)菌稱號表包含細(xì)菌的編號ID和稱號na

9、me。. 數(shù)據(jù)搜集及處置以美國國立生物醫(yī)學(xué)信息中心NCBI的Genbank為數(shù)據(jù)庫源，輸入關(guān)鍵詞“細(xì)菌屬名 S r進(jìn)展查詢-，得到同一個(gè)屬內(nèi)一切種的細(xì)菌S rDNA序列，以fasta格式顯示查詢結(jié)果，選擇長度在bp以上的序列以fasta格式保管為文本文件。利用clustal x 軟件進(jìn)展多序列對位陳列，找到能反響種的特異性序列-，然后運(yùn)用Bioedit軟件對陳列后的序列進(jìn)展編輯。選擇符合以下要求的序列：長度在-之間，較短探針特異性較差，較長那么添加非特異性雜交；堿基成分為G+C含量在-mol%之間，超出此范圍會添加非特異性雜交；序列內(nèi)不存在互補(bǔ)區(qū)，即不含有大于個(gè)堿基反向互補(bǔ)配對，否那么會出現(xiàn)抑

10、制探針雜交的“發(fā)夾狀構(gòu)造；沒有單一堿基的延續(xù)出現(xiàn)大于個(gè)，如-GGGGG-。然后經(jīng)過blastn和check-probe程序與知的各種基因序列進(jìn)展同源性比較和對此特異性序列進(jìn)展評價(jià)，選擇特異性較強(qiáng)的序列。運(yùn)用perl言語編寫程序?qū)lustal x和Bioedit軟件分析的結(jié)果進(jìn)展處置，生成預(yù)定的數(shù)據(jù)格式Genbank登錄號#細(xì)菌稱號，DNA序列：,共個(gè)左右這樣的數(shù)據(jù)依次陳列，將結(jié)果存入數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)格式如以下圖所示：圖 數(shù)據(jù)庫中多序列陳列結(jié)果數(shù)據(jù)格式. 編寫程序?qū)崿F(xiàn)對數(shù)據(jù)庫的查詢及管理為更加直觀地顯示細(xì)菌種的特異性寡核苷酸序列，利用perl和CGI公用網(wǎng)關(guān)接口技術(shù)開發(fā)一個(gè)可經(jīng)過web對數(shù)據(jù)庫進(jìn)展

11、查詢的系統(tǒng)，動態(tài)生成界面友好的查詢頁面。 結(jié)果. 數(shù)據(jù)庫的特點(diǎn)數(shù)據(jù)庫運(yùn)用英文作為主要言語，方便與國際上的同類數(shù)據(jù)庫進(jìn)展接軌以及與國際同類數(shù)據(jù)庫交換、共享數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫具有良好的操作界面。而且，本數(shù)據(jù)庫由于運(yùn)用效力器端Perl編程技術(shù)，對客戶端的閱讀器沒有特殊要求，支持用戶運(yùn)用各種閱讀器對數(shù)據(jù)庫進(jìn)展訪問，并且都能較好地顯示結(jié)果。數(shù)據(jù)庫的詳細(xì)操作界面見圖到圖。圖 數(shù)據(jù)庫主頁. 數(shù)據(jù)庫的功能此數(shù)據(jù)庫為設(shè)計(jì)細(xì)菌種特異性的S rDNA寡核苷酸探針提供參考和協(xié)助 ，從而到達(dá)加速對細(xì)菌進(jìn)展分類及鑒定的目的。輸入細(xì)菌稱號查詢，得到細(xì)菌的種特異性S rDNA寡核苷酸序列以及此序列所對應(yīng)的設(shè)計(jì)探針時(shí)的多序列陳列結(jié)果

12、，并且支持兩種查詢方式：準(zhǔn)確查詢和模糊查詢。圖 查詢結(jié)果頁面查詢結(jié)果闡明：Bacteria Name：細(xì)菌稱號；Probe Sequence：該細(xì)菌的種特異性寡核苷酸探針；Partial Seqence Align：點(diǎn)擊它所對應(yīng)的鏈接，顯示此寡核苷酸探針?biāo)鶎?yīng)的部分Clustal陳列結(jié)果，此結(jié)果包含探針序列及其左右兩端的部分序列，因此可根據(jù)不同的要求對探針序列進(jìn)展調(diào)整；Whole Seqence：點(diǎn)擊它所對應(yīng)的鏈接，那么下載此寡核苷酸探針?biāo)鶎?yīng)的全序列，下載的序列可以用Clustal x 或Bioedit翻開；Blastn：點(diǎn)擊它所對應(yīng)的鏈接，用Blastn程序?qū)Υ颂结樞蛄性贕enBank數(shù)據(jù)

13、庫中進(jìn)展同源性檢索；Check_Probe：點(diǎn)擊它所對應(yīng)的鏈接，用Check_Probe程序?qū)Υ颂结樞蛄羞M(jìn)展特異性評價(jià)。圖 探針?biāo)鶎?yīng)的多序列陳列頁面多序列陳列頁面闡明：左邊Genbank Access number所對應(yīng)的列代表用Clustal進(jìn)展多序列對位陳列時(shí)所用細(xì)菌的Genbank登錄號，中間的列代表用Clustal進(jìn)展多序列對位陳列時(shí)所用細(xì)菌的稱號。右邊的列是用Clustal進(jìn)展多序列對位陳列的結(jié)果。 討論細(xì)菌種特異性的S rDNA寡核苷酸探針數(shù)據(jù)庫是一個(gè)簡約的，查詢結(jié)果籠統(tǒng)直觀的公用二級數(shù)據(jù)庫，國內(nèi)外尚未報(bào)道這種數(shù)據(jù)庫，其查詢結(jié)果籠統(tǒng)直觀，ATGC四種堿基分別用紅綠黃藍(lán)四種不同的顏

14、色來表示，特異性序列一目了然見圖，可以快速進(jìn)展細(xì)菌種的特異性寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)，省去了從網(wǎng)上搜索序列，對序列進(jìn)展多序列對位陳列比較，尋覓特異性序列等一系列過程，從而節(jié)約了大量時(shí)間。數(shù)據(jù)庫中曾經(jīng)有迄今為止能設(shè)計(jì)種特異性探針的大部分細(xì)菌的特異性的S rDNA寡核苷酸序列大約種細(xì)菌。在設(shè)計(jì)細(xì)菌的S rDNA寡核苷酸探針時(shí)，他們只設(shè)計(jì)了Genbank中一個(gè)種含有三條及三條以上S rDNA，并且長度大于bp的細(xì)菌的種特異性的S rDNA寡核苷酸探針，太少的序列少于三條或者太短的序列在用clustal x進(jìn)展多序列對位陳列比較、尋覓特異性序列時(shí)沒有意義。由于目前絕大部分以上種的細(xì)菌的S rDNA序列太少，

15、只需一條或兩條，以及相當(dāng)一部分的細(xì)菌在Genbank中沒有S rDNA序列，因此無法設(shè)計(jì)探針，如Paenibacillus chibensis，Paenibacillus daejeonensis等細(xì)菌。但由于每周都有大量新的細(xì)菌的S rDNA提交到Genbank等公共數(shù)據(jù)庫中，所以，在補(bǔ)充了新的數(shù)據(jù)后對該類細(xì)菌就有能夠能設(shè)計(jì)S rDNA寡核苷酸探針，因此，需求定期從網(wǎng)上下載新的數(shù)據(jù)，進(jìn)展分類整理，更新本地?cái)?shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫的規(guī)模也因此會不斷擴(kuò)展，思索到本數(shù)據(jù)庫這一特點(diǎn)，運(yùn)用了功能強(qiáng)大而且免費(fèi)的MySQL數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)。另外，根據(jù)S rDNA序列clustal多序列對位陳列比較的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌

16、不存在明顯的特異性序列，如Bacillus simplex，Bacillus macroides等細(xì)菌，因此不能設(shè)計(jì)這些細(xì)菌的種特異性的S rDNA寡核苷酸探針，需求用其它的方法對這些細(xì)菌進(jìn)展分類鑒定。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，這樣的細(xì)菌大約占。除了S rDNA外，細(xì)菌的其它DNA序列也可以用來設(shè)計(jì)種特異性的寡核苷酸探針，思索到這一點(diǎn)，本數(shù)據(jù)庫以后也將提供其它的細(xì)菌種特異性的非S rDNA寡核苷酸探針，以便和S rDNA寡核苷酸探針互補(bǔ)，從而可以更準(zhǔn)確的對細(xì)菌進(jìn)展分類鑒定。同時(shí)，細(xì)菌有不同的分類程度，本數(shù)據(jù)庫以后也將收錄細(xì)菌其它分類程度的特異性寡核苷酸探針，如科特異性寡核苷酸探針，屬特異性寡核苷

17、酸探針等，從而使數(shù)據(jù)庫更完善，更有適用價(jià)值。 附錄 本數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為： HYPERLINK 。參 考 文 獻(xiàn)王建民,等.水稻矮縮病毒基因組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建,微生物學(xué)報(bào), ,:-.李阜棣等主編.微生物學(xué).中國農(nóng)業(yè)，.沈萍主編.微生物學(xué).高等教育,.Delong EF,et al.Phylogenetic strains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cellsJ .Science ,:-.Tadashi M,et al.S rRNA-Targeted identification of cyanobacterial genera using oligonucleotide-probes immobilized on bacterial magnetic particles.J.Applied Phycology ,:-.蔡妙英等主編.細(xì)菌稱號第二版. 科學(xué)，.George M. Garrity, et al. Taxonomic outline of the prokaryotes Bergey