1、實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的比色定量分析 考馬斯亮藍(lán)法實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜し止夤舛扔?jì)的基本原理和使用方法掌握利用考馬斯亮藍(lán)定量分析蛋白質(zhì)的方法思考題1.考馬斯亮藍(lán) G-250 法測(cè)定蛋自質(zhì)含量的原理是什么？ 還有哪些蛋自質(zhì)定量法？ 2.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋自質(zhì)含量時(shí)，應(yīng)該注意些什么？ 利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)呈紅褐色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，前者最大吸收波長(zhǎng)為488nm，后者為595nm。在一定蛋白濃度范圍內(nèi)（0.011.0mg/ml），蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量分析。蛋白質(zhì)和考馬斯

2、亮藍(lán)G-250結(jié)合2min左右達(dá)到平衡，完全反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)器材 762分光光度計(jì) （1）分析天平（2）移液器（3）試管、試管架（4）燒杯（5）分光光度計(jì) 主要試劑1、生理鹽水：稱(chēng)0.9g NaCl，用蒸餾水定溶至100mL。 2、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/ml）：稱(chēng)小牛血清白蛋白100mg，用蒸餾水定溶至100mL。4、考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：稱(chēng)100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，加95%乙醇50mL，加85%（W/V）H3PO4 100mL，用蒸餾水定溶至1000mL，置棕色瓶過(guò)夜，再用二層濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G-25

3、0，4.7%(W/V)乙醇。一、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線常量法標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)操作試管編號(hào)0123451mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(ml)0.00.010.020.030.040.05生理鹽水(ml)0.10.090.080.070.060.05考馬斯亮藍(lán)試劑(ml)各5ml搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色OD595nm取6支10ml干凈試管 按下表取樣，混勻，放置2min。在595nm 下比色，紀(jì)錄數(shù)據(jù)。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量（mg/ml）為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的OD值，即可查出未知樣品的蛋白含量。 測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，實(shí)驗(yàn)證明此復(fù)合物的吸附量可以忽略。測(cè)定結(jié)束后，可用乙醇將比色杯壁上的藍(lán)色洗干凈。注意事項(xiàng)計(jì)算結(jié)果 OD595nm值對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)含量（mg/ml） 樣品蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=稀釋倍數(shù)制備待測(cè)樣品：已準(zhǔn)備好。二、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定測(cè)定：取1 支10mL 試管，按下表取樣。管 號(hào)1待