1、細胞凋亡及檢測技術(shù)1第一節(jié)概 述一、細胞凋亡的概念細胞凋亡(apoptosis，這是1972年Kerr等建議用來描述伴隨細胞死亡的一系列形態(tài)學(xué)上固定的變化形式的。細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，最后細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體(apoptotic bodies，而被其他細胞吞噬?！暗蛲觥币辉~來自希臘語，apo意為“分離”，ptosis指花瓣或樹葉的脫落，“凋亡”是由這兩個詞組合而成，意指細胞凋亡的形態(tài)類似秋天花瓣或樹葉的凋落一樣。2二、研究簡史半個世紀前:人們就觀察到在生物的發(fā)生、生長、發(fā)育以及衰老過程中，一直伴隨著組織細胞的生理自發(fā)退化死亡現(xiàn)象.196

2、5年:發(fā)育生物學(xué)家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一詞，用于描述蛾的發(fā)育過程，認為隨著成年蛾的出現(xiàn)，其幼蟲死亡是一種發(fā)育調(diào)節(jié)性死亡。3 1972年:Kerr等首次提出了細胞凋亡的概念，從形態(tài)學(xué)角度描述細胞的生理死亡，并認為這是維持組織細胞動力學(xué)平衡的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。1977年:人們注意到在生理或病理性刺激條件下，淋巴細胞發(fā)育過程中的凋亡現(xiàn)象。并認為這是維持組織細胞動力學(xué)平衡的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。 4 1980年:Wyllie研究胸腺細胞在糖皮質(zhì)激素作用下引致的細胞凋亡變化，總結(jié)并建立了細胞凋亡的共同

3、形態(tài)學(xué)特征，包括核固縮和DNA降解成寡核苷酸片段等。1989年: 0wen及其研究小組在研究胸腺細胞陰性選擇過程中，發(fā)現(xiàn)T細胞受體(TCR)與自身抗原相互作用與未成熟T細胞的PCD發(fā)生有關(guān)，并在體外證實剌激CD3分子可誘導(dǎo)未成熟T細胞PCD的發(fā)生。證明了信號傳遞物質(zhì)對PCD的調(diào)控作用。5 1991年:Ellis首先發(fā)現(xiàn)了線蟲(C.elegans)體內(nèi)Ced-3、4兩個基因與PCD的發(fā)生密切相關(guān)，隨后逐漸發(fā)現(xiàn)了多種參與PCD的正相調(diào)節(jié)基因和負相調(diào)節(jié)基因，前者包括Ced-2、p53、cmyc、Fas、糖皮質(zhì)激素受體及白細胞介素1轉(zhuǎn)化(ICE等基因，后者則有Ced-9、bcl-2、p53等基因.6三

4、、細胞凋亡的特征細胞凋亡與細胞壞死雖然都是細胞死亡，但細胞凋亡的形態(tài)及生化特征與壞死性細胞死亡的特點則不同7（一）細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變： 組織內(nèi)單個細胞或小團細胞的死亡 不引發(fā)細胞自溶，也不引起炎癥反應(yīng)電鏡下可見：凋亡細胞固縮 胞漿致密，細胞器密集、退變 核染色質(zhì)致密，聚集于核膜處 胞核裂解，胞漿形成多發(fā)性芽突 凋亡小體形成光鏡下：凋亡小體外被以胞膜，圓形或卵圓形，胞漿濃縮，強嗜酸性，可有可無固縮深染的核碎片。8細胞凋亡與細胞壞死在形態(tài)學(xué)上的差別 細胞凋亡 細胞壞死 單細胞丟失細胞膜發(fā)泡但仍完整,細胞膜內(nèi)陷將細胞分割成凋亡小體不發(fā)生炎癥反應(yīng)被臨近正常細胞或吞噬細胞吞噬溶酶體完整染色質(zhì)均一凝集

5、細胞成群丟失細胞膜不完整,細胞腫脹、溶解發(fā)生嚴重炎癥反應(yīng)被巨噬細胞吞噬溶酶體裂解染色質(zhì)凝集成塊、不均一 91011細胞壞死時核的變化12細胞壞死時的炎癥反應(yīng)13(二)細胞凋亡的生化改變：凋亡過程中出現(xiàn)的生化改變以DNA的片段化及蛋白質(zhì)的降解最為重要。1)DNA的片段化 組成染色質(zhì)的DNA鏈被激活的核酸內(nèi)切酶切割，可形成180200bp或其整倍數(shù)的片段，電泳中呈特征灶的“梯”狀條帶，這是判斷凋亡發(fā)生的客 觀指標之一。2)蛋白質(zhì)的降解 凋亡蛋白酶激活，水解細胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞解體并形成凋亡小體、水解相關(guān)活性蛋白，從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能。14細胞凋亡與細胞壞死在生物化學(xué)上的區(qū)別

6、細胞凋亡細胞壞死生理因素誘導(dǎo)非生理因素造成的意外損傷受大分子合成和激活過程的嚴格調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)喪失需要能量不需要能量需要大分子合成不需要核酸和蛋白質(zhì)的合成有新基因從頭轉(zhuǎn)錄沒有新基因轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)非隨機降解為DNA“梯帶”染色質(zhì)DNA隨機降解15四、細胞凋亡的過程與調(diào)控 凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡基因激活細胞凋亡的執(zhí)行凋亡細胞的清除(一)凋亡的四個階段： 16凋亡誘導(dǎo)因素+ 受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號凋亡基因激活DNase激活Caspase激活巨噬細胞吞噬分解凋亡細胞17（二）細胞凋亡的調(diào)控1 . 細胞凋亡的相關(guān)因素（1） 誘導(dǎo)性因素激素和生長因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴細胞凋亡）或過多（糖皮質(zhì)

7、激素，淋巴細胞凋亡） 理化因素：射線、高溫、強酸、強堿、乙醇、抗癌藥物等 免疫性因素：如，CTL分泌粒酶靶細胞凋亡微生物因素：細菌、病毒及毒素。（HIV） 18（2）抑制性因素： 細胞因子：IL-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子激素：ACTH、睪丸酮、雌激素等二價金屬陽離子：Zn2+藥物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、中性氨基酸病毒：EB病毒、牛痘病毒CrmA192 .細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DNA片段化斷裂及細胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)。凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的特點：多樣性：不同種類細胞有不同系統(tǒng)耦聯(lián)性：凋亡與增殖分化系統(tǒng)在某些環(huán)節(jié)交、耦聯(lián)，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性：不

8、同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)20研究較多的系統(tǒng)：依據(jù)：細胞凋亡時胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著上升用Ca2+載體A23187人為升高B淋巴細胞Ca2+水平，B淋巴細胞凋亡用Ca2+絡(luò)合劑降低胞內(nèi)Ca2+水平，阻止細胞凋亡 激活Ca2+依賴谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶Ca2+ 活化核轉(zhuǎn)錄因子1胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)（Ca2+為第二信使）212cAMP/PKA信號系統(tǒng)（cAMP為第二信使）依據(jù)：雙丁酰cAMP可引起培養(yǎng)的髓樣白血病細胞及胸腺細胞凋亡糖皮質(zhì)激素使cAMP上升cAMP激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（蘇、絲AA）殘基磷酸化改變蛋白質(zhì)功能223Fas蛋白/Fa

9、s配體信號系統(tǒng)Fas蛋白：細胞膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配體（抗Fas）細胞凋亡機制：Fas蛋白+Fas配體（抗Fas）神經(jīng)鞘磷脂酶活性產(chǎn)生神酰胺蛋白激酶激活細胞凋亡Fas蛋白+抗Fas、TNF 激活I(lǐng)CE樣caspase 降解H1組蛋白染色體松馳DNA暴露內(nèi)切酶位點通過Ca2+信號系統(tǒng)傳遞死亡信息引起細胞凋亡234神經(jīng)酰胺信號系統(tǒng)神經(jīng)酰胺：神經(jīng)鞘磷脂（SM）在神經(jīng)鞘磷脂酶的作用下產(chǎn)生的一類新型第二信使物質(zhì)。介導(dǎo)細胞凋亡的依據(jù)：用天然神經(jīng)酰胺處理u937白血病細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡神經(jīng)酰胺途徑相關(guān)誘因：電離輻射、TNF-、Fas抗原、糖皮質(zhì)激素 245二酰甘油/蛋白激酶C（PKC）信號系統(tǒng)二酰甘

10、油：磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在磷脂酶C催化下產(chǎn)生的一種第二信使物質(zhì)。依據(jù)：活化的PKC1可誘導(dǎo)u937白血病細胞凋亡抑制PKC活性可抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠胸腺細胞凋亡PKC激動劑佛波脂可抑制某些類型細胞凋亡（糖皮質(zhì)激素、T細胞受體激活、IL-2撤除）256酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)生長因子或細胞因子激活酪氨酸蛋白激酶靶蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活通過Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白質(zhì)磷酸化細胞分化生長因子或細胞因子撤除不能激活酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)細胞凋亡263.凋亡相關(guān)基因三類：抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP促進凋亡基因：P53、Bax、ICE雙向調(diào)節(jié)基因：c-myc、Bclx27(B細

11、胞淋巴瘤/白血病-2B cell lymphoma / leukemia-2基因的縮寫) Bcl-2蛋白：229個氨基酸（人）、236個氨基酸（小鼠）分布：線粒體內(nèi)膜、細胞膜內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜作用：Bcl-2高表達能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素所引起的細胞凋亡依據(jù)：導(dǎo)入Bcl-2基因質(zhì)?？煞乐股窠?jīng)細胞因撤除神經(jīng)生長因子所誘導(dǎo)的凋亡淋巴細胞有20%呈Bcl-2陽性時，預(yù)后不佳（耐受放射線、抗癌藥物）1.Bcl-228 直接的抗氧化作用 抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)（細胞色素C、AIF） 抑制促凋亡性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)Bax、Bak的細胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活 維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)Bcl-2抗凋

12、亡作用機制：29作用：野生型（wtP53）：DNA結(jié)合蛋白，誘導(dǎo)細胞凋亡（“分子警察”）突變型：抑制細胞凋亡野生型P53的作用機制：P53蛋白細胞周期G1期檢查染色體DNA損傷（檢查點功能）發(fā)現(xiàn)DNA損傷剌激CIP的表達阻止細胞進入下一周期，啟動DNA修復(fù)機制修復(fù)失敗啟動細胞凋亡機制細胞凋亡2.P5330c-myc: 一種癌基因，它能誘導(dǎo)增殖，也能誘導(dǎo)細胞凋亡，具有雙向調(diào)節(jié)作用。作用機制：c-myc蛋白為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既可介導(dǎo)細胞增殖的基因，也可激活介導(dǎo)細胞凋亡的基因，其作用取決于細胞接受何種信號及細胞的生長環(huán)境（有生長因子增殖，無生長因子凋亡）。Bcl-x：能翻譯Bcl-XL和Bcl-

13、Xs兩種蛋白，Bcl-XL蛋白抑制細胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促進細胞凋亡（合成以誰為主） 3.c-myc,Bcl-x31五、 細胞凋亡的發(fā)生機制（一）氧化損傷氧化損傷的后果之一：細胞凋亡依據(jù)：各種氧化劑（H2O2）可直接誘導(dǎo)細胞凋亡抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可誘導(dǎo)細胞凋亡抗氧化劑（VitE、胡蘿卜素等）可阻斷有氧化應(yīng)激背景的各種凋亡誘導(dǎo)因素（TNF-、電離輻射）引起的細胞凋亡32引起DNA損傷，激活P53基因引起DNA損傷，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量ATP攻擊細胞膜不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過氧化，細胞膜損傷或產(chǎn)生過氧羥基24碳四烯酸激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶細胞

14、膜損傷，Ca2+內(nèi)流增多及損傷線粒體，通透性增加膜電位改變活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-B、AP-1，加速凋亡相關(guān)基因表達氧化損傷引起細胞凋亡的可能機制：33（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡是細胞凋亡的重要機機制之一依據(jù)：各種凋亡刺激所引起的凋亡是鈣依賴過程凋亡發(fā)生時胞漿Ca2+濃度顯著上升，并在隨后的一系列凋亡改變中起關(guān)鍵性作用（核酸內(nèi)切酶激活、需鈣蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的激活，細胞膜的空泡化）鈣穩(wěn)態(tài)失衡參與多種凋亡相關(guān)疾病的發(fā)病（神經(jīng)退行性疾?。?4激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化肽鏈間的?；D(zhuǎn)移酶，肽鏈間形成共價鍵，使細胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)

15、，有利于凋亡小體形成激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因表達Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈舒展，暴露核小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細胞凋亡的可能機制：35（三）線粒體損傷線粒體的改變：線粒體內(nèi)膜通透性增大，線粒體內(nèi)膜跨膜電位（m）下降，能量代謝水平顯著降低線粒體改變在細胞凋亡發(fā)生中起關(guān)鍵作用依據(jù)：抑制線粒體的三羧酸循環(huán)或呼吸鏈功能可誘導(dǎo)細胞凋亡在細胞核出現(xiàn)凋亡改變之前，常先有線粒體內(nèi)膜跨膜電位（m）下降阻止線粒體通透性的改變，可防止細胞凋亡（Bcl-2）36線粒體改變引起細胞凋亡的機制： Ca2+NO缺血原卟啉活性氧線粒體m下降Bcl-2 (-)PT

16、P開放Apaf+Cyt.CCaspase-9酶原Caspase-9(+)Caspase-3酶原Caspase-3(+)Caspase抑制劑AIF(-)蛋白質(zhì)水解細胞凋亡DNA斷裂無活性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶激活(+)(+)37第二節(jié) 細胞凋亡的檢測方法 細胞凋亡檢測方法：歸納起來，可分三方面，即根據(jù)凋亡的形態(tài)學(xué)特征、細胞凋亡的生化特征以及細胞凋亡的流式細胞儀檢測。本節(jié)主要介紹細胞凋亡的常用病理學(xué)檢測方法。38一、蘇木精-伊紅染色方法(HE染色)1石蠟組織切片HE染色（略）2細胞爬片或細胞涂片的HE染色39（1）細胞爬片或細胞涂片的制備： 貼壁生長細胞(包括腫瘤細胞)：讓細胞生長在蓋玻片使其在上面

17、爬行生長。取出蓋玻片，經(jīng)PBS輕輕漂洗后，用4%的甲醛或多聚甲醛在常溫下固定510min，即可染色。 懸浮生長細胞(包括腫瘤細胞)或貼壁生長的細胞經(jīng)消化脫壁成單細胞懸液后，可經(jīng)細胞涂片后染色。（2）染色方法:同石蠟組織切片HE染色，免去第1和第2步。 40【結(jié)果判斷】 1.光學(xué)顯微鏡下細胞核呈藍黑色，胞漿呈淡紅色。凋亡細胞在組織中單個散在分布，表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂等。 2.在細胞爬片上，凋亡的細胞變圓、變小，可見細胞核固縮、碎裂，染色體被染成深藍色或藍黑色；可見細胞膜皺折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies。而正常細胞經(jīng)染色后仍保持細胞原有的生

18、長形狀(如梭形或多角形)，細胞核規(guī)整，染成均一藍色。細胞涂片時可見凋亡細胞核固縮、碎裂，染色變深；正常細胞染色體顯均勻淡藍色或藍色，而壞死細胞細胞腫脹，可見細胞膜的連續(xù)性破壞，核染色體染成很淡的藍色甚至消失。4142 嗜酸性小體(凋亡)嗜酸性變及嗜酸性小體肝細胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，呈嗜酸性變；或胞漿進一步濃縮，細胞變圓，核碎裂、溶解消失，呈嗜酸性小體狀43二、甲基綠-派諾寧染色法44【染色原理】 細胞凋亡和細胞壞死均可表現(xiàn)為細胞核固縮等細胞死亡形態(tài)，但兩者發(fā)生機制不同。細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要有細胞內(nèi)蛋白酶的激活，細胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達的增強。而細胞壞死則是一種被動的細胞死亡

19、過程，細胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根據(jù)這一特點，可應(yīng)用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性，使甲基綠對固縮細胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞，呈陰性染色者為壞死細胞。45【試劑及配制】1.組織固定液 無水乙醇600ml 氯 仿300ml 冰乙酸100ml 462.甲基綠純化 新購買的甲基綠(methyl green)需用氯仿進行純化處理以去除甲基紫。方法是將2%甲基綠水溶液20ml傾入潔凈分液漏斗，加入氯仿20ml充分混勻，使其內(nèi)的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶紫紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，

20、如此反復(fù)更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4保存。473.染色液甲基綠貯存液5m15%派諾寧水溶液lm1蒸餾水12m12mol/L乙酸鈉(pH4.8)18ml(臨用前配制，濾紙過濾) 48【操作方法】1.新鮮取材組織置組織固定液中4固定36h；2.直接轉(zhuǎn)入95%乙醇脫水和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；3.切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水；4.置染色液中室溫下染片約lh；5.取出切片，不經(jīng)水洗，用濾紙吸干多余染液；6.插入丙酮中迅速分化；7.轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯(1:1)稍洗；8二甲苯透明23次；9中性樹膠封固 49【結(jié)果判斷】 凋亡細胞：光學(xué)顯微鏡下凋亡細胞細胞核固縮呈綠色或綠

21、藍色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染。觀察時可用凋亡指數(shù)進行計數(shù)，即隨機選擇約1020個視野(每張切片約10002500個細胞，計數(shù)凋亡細胞百分率。細胞壞死：只有固縮細胞核呈綠色著染。 5051三、吖啶橙染色法【染色原理】吖啶橙的熒光隨pH而變，其正色為綠色，隨pH下降可變到橙紅色。吖啶橙與DNA和RNA通過兩個部位結(jié)合，連接堿基對和磷酸鹽基團，吖啶橙與堿基對結(jié)合，形成第一復(fù)合物。第二復(fù)合物在多核苷酸表面，由吖啶橙與磷酸鹽基團連接而成。pH 6.0時，DNA結(jié)合染料的聚合加速，pH低于3.8時，聚合受抑制，而RNA在pH 6.0和3.8都能聚合而使顏色變紅。 52【試劑及配制】 吖啶橙貯存液:10mg吖

22、啶橙溶解于100ml PBS中，pH 4.86.0濾過，40C避光保存【操作方法】1.制備活細胞懸液，濃度約為107/ml2.取95l細胞懸液，加5l吖啶橙貯存液混勻3.吸一滴混合液滴于潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片4.熒光顯微鏡選用激發(fā)濾片BG12，BV等，阻斷濾片用515nm或SP3 53【結(jié)果判斷】 正常細胞：在熒光顯微鏡下，細胞核DNA為黃色或黃綠色均勻熒光，細胞質(zhì)和核仁的RNA為桔黃或桔紅色熒光 凋亡細胞：細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片 壞死細胞：細胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光均可減弱或消失 5455四、原位末端標記 原位末端標記（ISEL)是將滲入到凋亡細胞中

23、的外源性核苷酸在酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和DNA聚合酶I或KIenow大片段的催化下與凋亡細胞因內(nèi)源性核酸酶的激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，再通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法:末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(簡稱TUNEL)；DNA聚合酶I或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移(簡稱INST)。在不考慮所使用的催化酶時，統(tǒng)稱為原位末端標記。56 TUNEL鑒定的原理基于細胞凋亡時產(chǎn)生DNA斷鏈，所介導(dǎo)的酶是TdT，該酶能將外源性的生物素或地高辛標記的dUTP無需DNA模板連接到凋亡細胞核的DNA斷鏈的3-羥基(3-0H末端，DNA斷鏈可是單股斷鏈也可是

24、雙股斷鏈，兩種斷鏈都有游離的3-羥基末端，因此，TUNEL鑒定可以檢測凋亡細胞核中的單股和雙股DNA斷鏈。57【試劑準備和配制】1. 0.15mol/L 的PBS: 0.15mol/L NaCl， 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液；2蛋白酶K 20g/ml， 0.15mol/L的PBS配制；3組織預(yù)處理液(2SSC溶液):先配制20SSC溶液作為儲存液，用時10倍稀釋(1SSC溶液含 0.3mol/L NaCl， 30mmol/L枸橡酸納)；4內(nèi)源酶阻斷劑:3%H202-甲醇溶液（或PBS）585緩沖液A(buffer A250mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L MgC12， 10

25、mmol/L -巰基乙醇， 0.005% BSA，pH 7.56鏈卵白素標記的辣根過氧化物酶；7DAB-H202顯色液:DAB用0.1mol/L Tris-Cl(pH7.6)配成0.4%，分裝一20避光保存；8TdT緩沖液(pH6.8) 二甲胂酸納(Na-Cacodylate 100mmol/L二琉基蘇糖醇(dithiothrenol 0.1mmol/L氯化鉆(C00) 5mmol/L9TdT反應(yīng)液在TdT緩沖液中加入TdT酶100U/ml， 0.001mmol/L biotin-11-dUTP59【染色步驟】1.切片常規(guī)脫蠟，復(fù)水，后續(xù)過程在濕盒內(nèi)進行；2.3%的H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

26、30min；3.0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；4.切片浸泡在2SSC 80 20min；5.0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；6.蛋白酶K消化020min；7.0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；8.TdT緩沖液孵育 10min609. TdT反應(yīng)液37孵育 1h；10.切片浸泡在2SSC溶液10min，以終止反應(yīng)；11. 0.15mol/L的PBS洗3次5min；12. 鏈卵臼素標記的辣根過氧化物酶孵育30min（POD）；13. 0.15mol/L的PBS洗3次，每次5min；14.0.04%的DAB顯色510min，鏡下控制時間；15.蘇木精對

27、比染色10-30sec，常規(guī)復(fù)水、透明和封固。 61【結(jié)果判斷】 凋亡細胞的核呈棕色或棕褐色著染，細胞核形態(tài)呈碎點狀，不規(guī)整，大小不一致。而正常非凋亡細胞和陰性對照片核被蘇木素復(fù)染呈藍色，核相對較大，形態(tài)大小較為一致6263第三節(jié) 細胞凋亡的應(yīng)用一細胞凋亡與機體發(fā)育 細胞凋亡是多細胞動物生命活動過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是動物借以存活的需要，因而貫穿于動物全部壽命周期中。無論是低等動物還是高等動物，都是如此。在哺乳動物胚胎發(fā)生、發(fā)育和成熟過程中，構(gòu)成組織的細胞生死交替，細胞凋亡是保證個體發(fā)育成熟所必需的。 64二細胞凋亡與機體穩(wěn)態(tài) 組成機體的細胞不但需要不斷地與環(huán)境進行物質(zhì)、信息和能量的交換，

28、而且這些細胞本身也處在不斷的更新中。這種更新是以細胞數(shù)量上的恒定為前提的，因此是一種動態(tài)平衡狀態(tài)，顯然，各種細胞數(shù)量上穩(wěn)定，不但保證了機體各組織器官具有形態(tài)學(xué)上的穩(wěn)定性，同時也是機體生理功能或內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的必要條件。沒有這種細胞生理性死亡，細胞更新就不可能發(fā)生，因此，細胞產(chǎn)生與細胞凋亡之間的平衡是機體穩(wěn)態(tài)的基本條件，它們的平衡一旦破壞，就會導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生 65三、 細胞凋亡與疾?。ㄒ唬┘毎蛲霾蛔?. 腫瘤發(fā)生機制：目前認為：細胞增殖過度是腫瘤發(fā)病的一個途徑，凋亡受抑、細胞死亡不足是腫瘤發(fā)病的另一途徑，結(jié)果導(dǎo)致病變組織內(nèi)腫瘤細胞存活延長，存活大于死亡，腫瘤細胞數(shù)目凈增長加大，形成新生物。凋亡受抑

29、的依據(jù)：多種腫瘤組織中Bcl-2表達顯著高于周圍組織許多腫瘤P53發(fā)生突變，突變型P53抑制細胞凋亡（肺小細胞癌等） 66近年腫瘤領(lǐng)域中凋亡的研究主要集中在以下幾個方面：腫瘤發(fā)生過程中凋亡的意義:腫瘤發(fā)生過程中的凋亡現(xiàn)象將有利于從細胞死亡角度考察腫瘤的形成。凋亡與細胞周期:細胞增殖與凋亡的關(guān)系是凋亡細胞離開了正常有絲分裂軌道,走向死亡。對于凋亡啟動與細胞周期時相的關(guān)系尚有不同的觀點,一些作者以為, 凋亡只發(fā)生于G。/G1期,而大部分作者認為凋亡是多點啟動的,可源于細胞周期的任何時相。 67凋亡與信號轉(zhuǎn)導(dǎo):信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明將對腫瘤的防治產(chǎn)生巨大影響。凋亡與腫瘤生長: 凋亡與增殖是一對并存的矛盾

30、,正常狀況是二者維持動態(tài)平衡,癌前病變和腫瘤的增生與凋亡失調(diào)有關(guān),此外,腫瘤誘導(dǎo)分化中的細胞凋亡、腫瘤治療中的細胞凋亡及腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中的細胞凋亡亦是近年研究的熱點?？梢灶A(yù)見, 細胞凋亡的研究對腫瘤的預(yù)防和治療,具有重大的理論意義和應(yīng)用價值。68發(fā)生機制：從細胞凋亡角度看自身免疫病的發(fā)病是由于細胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T細胞所致。依據(jù)：糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡，為治療自身免疫病的有效藥物之一。2. 自身免疫病69(二) 細胞凋亡過度1. 心血管疾病(1) 心肌缺血與心肌缺血-再灌注損傷目前認為：心肌缺血與心肌缺血-再灌注損傷造成的心肌細胞損傷不但有壞死，也有細胞凋亡（干預(yù)靶點）。細胞凋亡的特點：缺血早期以細胞凋亡為主，晚期以細胞壞死為主梗死灶中央通常以壞死為主，周邊部分以細胞凋亡為主輕度缺血以細胞凋亡為主，重度缺血通常以壞死為主70在一定的時間范圍內(nèi)，缺血-再灌注損傷時發(fā)生的細胞凋亡比同時間的單純?nèi)毖鼑乐丶毙?、嚴重的心肌缺血以壞死為主，慢性、輕度的心肌缺血以細胞凋亡為主細胞凋亡的機制：氧化應(yīng)激有關(guān)（SOD可減少細胞凋亡）Fas上調(diào)通過與