1、FAK基因表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及運(yùn)動(dòng)的影響【關(guān)鍵詞】小干擾rna;結(jié)直腸癌;fak;細(xì)胞增殖;細(xì)胞運(yùn)動(dòng)effetsffakexpressinlevelnprliferatinandtilityflretalarinaellslabfturellularandleularbilgy,llegeflifesienes,shaanxinraluniversity,xian710062,hinakeyrdssallinterferingrna;lretalaner;fak;ellprliferatin;elltility1材料和方法1.2方法1.2.3gfp表達(dá)檢測(cè)及轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞于激發(fā)波

2、長(zhǎng)為488n的熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)gfp的表達(dá)情況。以放大100倍的視野為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)5個(gè)視野表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù),求gfp表達(dá)率:gfp表達(dá)率=發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100%。1.2.4細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2105/孔接種于鋪有無(wú)菌蓋玻片的6孔板中,每組爬片4張,轉(zhuǎn)染48h后棄培養(yǎng)液,pbs洗3次,40g/l多聚甲醛4固定15in,pbs洗3次,吸凈液體,每孔參加200lheshst33258工作液,避光孵育10in,pbs漂洗封片,熒光顯微鏡下隨機(jī)選取高倍視野進(jìn)展拍照,激發(fā)光波長(zhǎng)為365n。1.2.6細(xì)胞增殖檢測(cè)調(diào)整細(xì)胞密度為6000個(gè)/孔,接種至96孔板,設(shè)bl

3、ank組(只加完全rpi1640培養(yǎng)液)、sirnasr組、正常對(duì)照組、干擾組(sifak1、sifak2),每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后棄上清,進(jìn)展轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體:0.5l,dna:0.2g)。于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96h后每孔參加tt(1g/l)15l,37、50l/l2避光孵育5h,再參加100lds振蕩10in,酶標(biāo)儀562n處測(cè)定各孔a值。生長(zhǎng)抑制率=(1-處理組平均a值)/正常對(duì)照組平均a值100%。1.2.7細(xì)胞遷移檢測(cè)于6孔板內(nèi)按上述方法進(jìn)展轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)24h后用外接真空泵的1l移液槍頭(直徑1.5)垂直于6孔板板底分別打孔,pbs清洗2次,更換完全培養(yǎng)液。分

4、組同1.2.2,40倍倒置顯微鏡下照相。于轉(zhuǎn)染后48、72、96、120h繼續(xù)照相,genetls軟件測(cè)定每孔各時(shí)間點(diǎn)面積。遷移率=(1-該時(shí)間點(diǎn)損傷面積)/原始損傷面積100%。1.2.8免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)將細(xì)胞接種于鋪有無(wú)菌蓋玻片的6孔板中(1.5105/孔),每組爬片4張。設(shè)陰性對(duì)照組(pbs代替一抗)、sirnasr組、正常對(duì)照組、sifak1和sifak2共5組。轉(zhuǎn)染48h后取蓋玻片用sp試劑盒檢測(cè),fakab稀釋度為1300,避光條件下,dab顯色,三蒸水沖洗停顯,梯度酒精脫水,二甲苯透明,取出蓋玻片置于載玻片上,胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色為陽(yáng)性染色。中性樹(shù)膠封片后,每組隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(

5、200),進(jìn)展圖像采集。1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以xs表示,采用spss15.0軟件進(jìn)展方差分析。p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.2轉(zhuǎn)染效率經(jīng)優(yōu)化的脂質(zhì)體條件轉(zhuǎn)染后,gfp表達(dá)率為(44.592.71)%。2.5細(xì)胞增殖狀況tt法檢測(cè)說(shuō)明,sifak1和sifak2組細(xì)胞增殖抑制率明顯增加(圖4)。與正常對(duì)照組相比,sifak1和sifak2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率在轉(zhuǎn)染后2472h均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。隨著sifak1和sifak2對(duì)細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制效果越明顯,在轉(zhuǎn)染后48h時(shí)到達(dá)最高。其中sifak1的抑制作用更強(qiáng)。sirnasr組與正常組在各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義。3討論fak作為sr癌基因的底物,位于整合素富集的黏著斑處,與多種信號(hào)分子互相作用,介導(dǎo)多種細(xì)胞外表受體激活及信號(hào)傳輸來(lái)調(diào)控細(xì)胞骨架組建、細(xì)胞增殖、凋亡及存活、細(xì)胞轉(zhuǎn)移及入侵等,最終參與腫瘤的發(fā)生。有研究說(shuō)明,在正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中fak表達(dá)呈弱陽(yáng)性或陰性5,這與維持上皮細(xì)胞的生理功能是不可缺少的;而在結(jié)直腸癌相關(guān)的細(xì)胞中fak表達(dá)明顯升高,說(shuō)明其表達(dá)上調(diào)可能是結(jié)直腸癌具有惡性表型的早期事件。因此,fak作為腫瘤發(fā)生進(jìn)程相關(guān)的關(guān)鍵分子可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn),而抑制fak的表達(dá)那么有望成為腫瘤基因治療的新熱點(diǎn)。針對(duì)fak基因的反義寡核苷酸治療結(jié)直腸癌的研究已有報(bào)道6。rnai是近年來(lái)快速開(kāi)展

7、的一種高效的基因沉默技術(shù),并作為一種關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用于抗腫瘤、基因功能研究7。實(shí)驗(yàn)中2個(gè)sifak重組質(zhì)粒對(duì)靶基因的抑制效應(yīng)不同,其中以sifak1抑制fak基因rna、增殖及遷移的作用最為明顯,這種針對(duì)同一基因的不同靶點(diǎn)而產(chǎn)生的不同干擾效果,可能與位置效應(yīng)有關(guān)10。因此說(shuō)明利用rna干擾進(jìn)展腫瘤臨床治療要對(duì)干擾序列進(jìn)展篩?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】2潘寧,章藹然,侯穎春.黏著斑激酶活化與腫瘤進(jìn)程研究進(jìn)展j.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2022,16(12):2222-2227.3黃培新,劉恒,鐘敏章,等.黏著斑激酶在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)其遷移的影響j.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2022,14(4):257-260.5ane

8、g,harrisje,iaav,etal.iunhistheialanalysesffaladhesinkinaseexpressininbenignandalignanthuanbreastandlntissues:rrelatinithpreinvasiveandinvasivephentypesj.linanerres,2000,6(6):2417-2423.6alshf,thailselvanv,grtelueshenr,etal.absenefadhesintriggersdifferentialfakandsapkp38signalsins620huanlnanerellsthatayinhibitadhesivenessandleadtelldeathj.ellphysilbihe,2022,13(3):135-146.8argadant,vanpst