1、第二十六章 移植免疫及其免疫檢測第一節(jié) 器官移植與移植免疫特點第二節(jié) HLA配型與應用分析第三節(jié) 常見的組織或器官移植第四節(jié) 排斥反應的種類及發(fā)生機制第五節(jié) 排斥反應的免疫監(jiān)測第六節(jié) 常用免疫抑制藥物及其血藥濃度監(jiān)測1596年，意大利外科醫(yī)生成功進行最早一次成功的自體組織移植19世紀初，嘗試異體皮膚移植,但因排斥而失敗1940年，Medewar證實了同種異體移植排斥是一種免疫現(xiàn)象1954年，美國醫(yī)生Murray在單卵雙生姐妹間進行腎移植獲得成功1962年，應用HLA分型技術選擇合適的供體，第一次用無親緣關系的供體腎進行異體移植，獲得成功80年代初，由于環(huán)孢素A等應用，明顯提高了器官移植的成功率

2、，器官移植已廣泛應用于臨床 移植免疫學的發(fā)展史移植（transplantation）：將健康細胞、組織或器官從其原部位移植到自體或異體的一定部位、用以替代或補償機體所喪失的結構和（或）功能的現(xiàn)代醫(yī)療手段移植物（graft）：被移植的細胞、組織或器官供體(donor)：提供移植物的個體受體（recipient）或宿主（host）：接受移植物的個體 自體移植 同系移植 同種異體移植 異種移植 原位移植 根據移植部位分類 異位移植 器官移植 移植物種類分類 支架組織移植 細胞移植根據移植物來源分類移植的類型 移植名稱 供者、受者關系 舉例 自體移植 同一個體 自體斷肢再植，自體皮片移植 同系或同基因

3、移植 同系或同基因 人的單卵雙生子間的器官移植 的個體間 同品系小鼠的皮片移植 同種異基因移植 同種不同基因 人與人之間的腎移植 的個體間 不同品系小鼠間的皮片移植 異種移植 異種動物間 狗的器官移植給猩猩 豬的器官移植給狗 移植種類和命名 第一節(jié) 器官移植與移植免疫特點（一）移植器官或組織的抗原性（二）排斥移植物的記憶特性（三）負向免疫調節(jié)的必要性 一、器官和組織移植的一般規(guī)律二、HLA是誘導排斥反應最強的靶抗原 主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex,MHC）編碼的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA），是不

4、同個體間進行器官或組織細胞移植時發(fā)生排斥反應的主要成分 在三類HLA分子中，、類分子是觸發(fā)移植排斥反應的首要抗原，尤其是HLA-DR位點的抗原分子 HLA發(fā)揮雙重作用：介導宿主抗移植物反應(HVGR); 參與移植物抗宿主反應(GVHR)。 次要組織相容性抗原ABO血型抗原系統(tǒng)組織特異性抗原三、受體對HLA的識別與效應機制第二節(jié) HLA配型與應用分析HLA異質性決定了HLA型別判定方法的復雜性和多樣性HLA型別相同或相近個體器官移植成功高 一、HLA分型方法（一）血清學分型法 應用一系列已知抗HLA的特異性標準分型血清與待測淋巴細胞混合，借助補體的生物學作用介導細胞裂解的細胞毒試驗。耗時長不同批

5、號抗血清結果常有不同 操作簡便易行節(jié)約試劑、結果可靠、重復性好 無需特殊設備 優(yōu)點缺點用于HLA分型的微量細胞毒試驗死（著染）細胞（%）記分結果判斷0101陰性11202可疑陰性21504弱陽性51806陽性808強陽性0未試驗或不能讀數微量細胞毒試驗判定標準 （二）細胞學分型法 以混合淋巴細胞培養(yǎng)（mixed lymphocyte culture,MLC）或稱混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction,MLR）為基本技術的HLA分型法。能用本法測定的抗原稱為LD抗原（lymphocyte defined antigen）,包括HLA-D、-DP。MLC分為單向MLC

6、和雙向MLC 單向法：淋巴細胞(供者，X 線或絲裂霉素 處理) + 淋巴細胞(受者) 培養(yǎng) 淋巴母細胞(判定結果) 雙向法：淋巴細胞(供者) + 淋巴細胞(受者) 培養(yǎng) 淋巴母細胞(判定結果) 將已知HLA型別的分型細胞用絲裂霉素C或X線照射預處理，使其失去增殖能力僅作為刺激細胞；而以具有增殖能力的受檢者外周血單個核細胞為反應細胞。兩者混合培養(yǎng)時，反應細胞可對刺激細胞發(fā)生應答而增殖，用3H-TdR摻入法測定細胞增殖強度，從而判斷受檢細胞的HLA型別。 1. 單向MLC陰性分型法：純合子細胞分型法（HTC）陽性分型法：預致敏淋巴細胞分型法（PLT）根據選用的刺激細胞類型分為：1陰性分型法 2陽性

7、分型法 反應細胞+某種HLA-DP不同（其他HLA型相同）預致敏淋巴細胞+待測細胞（處理后刺激細胞）混合培養(yǎng) 遺傳型不同的兩個個體淋巴細胞在體外混合培養(yǎng)時，由于兩者HLA不同，能相互刺激導致對方淋巴細胞增殖，故稱雙向MLC。在此試驗中，各自的淋巴細胞既是刺激細胞，又是反應細胞，反應后形態(tài)上呈現(xiàn)的細胞轉化和分裂現(xiàn)象，可通過形態(tài)法計數轉化細胞 。2. 雙向MLC本法不能判斷型別，只能說明供、受體HLA抗原配合程度 （三）分子生物學分型法 分子生物學技術的迅速發(fā)展，使得HLA的DNA分型技術應運而生，并在開展DNA限制性片段長度多態(tài)性分析、DNA指紋圖、等位基因特異性寡核苷酸雜交等基礎上，引入多聚酶

8、鏈反應技術，使HLA分型得以在更精密的水平上進行。 限制性片斷長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）分析：最早建立的研究HLA多態(tài)性的DNA分型技術 PCR-RFLP分型法：對DNA片段進行體外擴增，然后再用限制性內切酶進行酶切分析，可使限制性長度分析的敏感度大大增加 1. RFLP與PCR-RFLP分型法 序列特異性寡核苷酸-聚合酶鏈反應（PCR-sequence specific oligonucleotide, PCR-SSO）是以PCR為基礎，將凝膠上擴增的HLA基因DNA轉移至硝酸纖維膜或尼龍膜，進而用放射性核素或酶

9、、地高辛等非放射性物質標記的寡核苷酸探針與之進行雜交，從而對擴增產物作出HLA型別判斷。 2. PCR-SSO分型法 分類：斑點或印漬法反向斑點或印漬法PCR-SSO是類HLA分型應用最廣泛的方法， 能夠鑒定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因是近年發(fā)展起來的一項新技術,將其與PCR-SSO結合應用于HLA分型，可使分型趨于規(guī)?；妥詣踊绕湓贖LA多態(tài)性和疾病遺傳背景分析等方面更具優(yōu)勢。HLA的基因芯片分型法，實際上是PCR-SSO反向斑點或印漬法的微型化。目前，基因芯片在HLA分型領域的應用尚屬起步階段?；蛐酒?gene chip)原理：應用設計的一套HLA等位基因的序列特異

10、性引物（sequence specific primer,SSP）,對待測DNA進行PCR擴增，從而獲得HLA型別特異性的擴增產物3. PCR-SSP分型法 HLA基因擴增的特異性包括：座位特異性（locus-specific），如HLA-A、B、-DRB1等；組特異性（group-specific），如DRB1-01、DRB1-02等；等位基因特異性（allele-specific），如DRB1*0401、DRB1*0402等。原理：對ssDNA進行無變性劑的聚丙烯酰凝膠電泳時，因其序列的差異可形成不同的空間構象而導致電泳遷移率的差異，如此可分辨出單一堿基的差異和檢測出DNA多態(tài)性或點突變，

11、有助于新的HLA等位基因或突變體的發(fā)現(xiàn)。 4.PCR-SSCP分型法 單鏈構象特異性聚合酶鏈反應（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）是以對待測基因PCR擴增為基礎，對擴增的單鏈DNA（ssDNA）的HLA分型方法。特點：PCR-SSCP作為PCR-SSO的補充，在區(qū)分純合子和雜合子基因方面有其獨到之處，有利于排除SSO雜交的假性?；具^程：分離待測細胞的DNA，應用座位、組或等位基因特異性引物進行PCR擴增，擴增產物的純化和測序，測出的基因序列與HLA基因庫的DNA已知序列比較，判斷待測的HLA型別。 5. SBT分型法

12、基于序列的HLA分型法（sequence-based HLA typing,SBT），通過對擴增后的HLA基因片段通過核酸序列測定來判斷HLA型別。金標準二、HLA分型的應用HLA是引起同種異型移植排斥反應的主要抗原供者與受者的HLA等位基因匹配程度決定了移植排斥反應的強弱程度通過HLA組織配型(tissue typing)，選擇合適的供者，減輕排斥反應 1.HLA配型供、受者HLA-A和HLA-B相配的位點數越多，移植物存活機率越高供、受者HLA-DR位點相配更重要，因為HLA-DR和DQ基因有很強的連鎖不平衡，DR位點相配的個體，通常DQ位點也相配；不同地區(qū)HLA匹配程度與移植結果的關系有

13、著不同的預測價值，在歐洲HLA匹配的程度對移植結果的預測性比美國高，因為歐洲人群的近交程度較高 ，導致HLA位點連鎖不平衡性削弱。 移植物存活與HLA配型的關系交叉配型采用補體依賴的細胞毒試驗(受者血清+供者淋巴細胞) 陽性對照:陽性對照血清可用淋巴細胞免疫家兔獲得 陰性對照:陰性血清可采用無受血史的AB血型男性血清根據反應時參與的細胞成分分類： 淋巴細胞交叉配型 T細胞淋巴細胞毒性交叉配型 B細胞淋巴細胞毒性交叉配型 流式細胞法交叉配型 自身交叉配型 結果判讀: 交叉配型陽性:表明受者預存有抗供體的抗體臨床意義: 交叉配型陽性:即使組織配型好，也不宜進行移植，易發(fā)生超急性排斥反應。 在做受體

14、選擇時，組織配型差，但交叉配型為陰性，仍可實施移植。 交叉配型常用于腎臟移植2.HLA交叉配型與預存抗體的檢測方法方法類型與參與成分需時應用組織配型補體依賴的淋巴毒試驗血清學法（HLA抗血清、補體、待測細胞）3hHLA、類抗原鑒定交叉配型PBL交叉配型血清學法（受著血清、供者細胞、補體、有/無AHG）3h檢測受者血清中已存在的抗供者抗體TB交叉配型血清學法（純化的供者T/B細胞、受者血清、AHG）3-6hT細胞： 檢測抗HLA I類抗體；B細胞：檢測HLA I、II類抗體MLC試驗細胞學法（供、受者細胞培養(yǎng)）6dHLA II類抗原相容性CML試驗細胞學法（受者細胞、供者刺激細胞作為靶細胞）4h

15、抗供者CTL檢測FCC血清學法（受者血清、供者細胞、熒光抗人Ig）3-4h檢測非常弱的和無細胞毒性的抗供者抗體自身交叉配型血清學法（受者PBL、T和B細胞以及血清）和FCC3-4h檢測非特異的淋巴細胞抗體（自身抗體）HLA抗體篩選HLA I類抗體的篩選血清學法（受者血清、相應的HLA類型T細胞或PBL）3h60細胞HLA I類抗體檢測，抗體特異性鑒定HLA II類抗體的篩選血清學法（吸附過的受者血清、用作HLA-DR/DQ分型的B細胞）4h60細胞數加吸附時間HLA II類抗體檢測，抗體特異性鑒定CML：細胞介導的淋巴細胞溶解試驗群體反應性抗體（panel reactive antibody,

16、PRA）：指用4060人含已知HLA的T細胞或T、B混合細胞，檢測待移植受者血清所得到的抗體陽性百分數。檢測意義: 用于判斷器官移植時受體的敏感程度 高PRA血清:可針對多個HLA抗原發(fā)生反應，受體對所接受的移植器 官或組織威脅大注意:應考慮在不同HLA上可能出現(xiàn)的共同表位或稱公共抗原（public antigens）與受體血清發(fā)生的交叉反應3.群體反應性抗體的檢測第三節(jié) 常見的組織或器官移植 臨床器官移植術的建立至今已有50多年的歷史。從腎臟移植到心肺移植、肝臟移植；從完整的器官移植到部分組織器官甚至是細胞移植；從單一的器官移植到器官聯(lián)合移植。 一、腎臟移植 腎臟移植，創(chuàng)始于1950年，是臨

17、床開展最早、應用最多和效果最佳的一種器官移植。 由于免疫抑制藥物的不斷更新和移植技術的不斷提高，腎臟移植患者1年和5年的存活率，分別可達90% 95%和80%90%。 組織配型是腎臟移植前選擇供者的重要手段 包括：ABO血型配型 HLA配型 交叉配型腎源選擇的原則：以ABO血型完全相同者為好，至少能夠相容選擇最佳HLA配型的供者器官1.組織配型在腎臟移植中的應用臨床觀測項目: T細胞總數、CD4/CD8比值和IL-2及其受體的檢測，判斷排斥反應的發(fā)生和評估免疫抑制劑治療效果 腎組織活檢，預測排斥反應的發(fā)生 CsA血藥濃度檢測，指導合理用藥，減少腎毒性 2.腎移植受者的療效檢測 療效監(jiān)測：受者免

18、疫狀態(tài)檢測二、肝臟移植 肝臟移植手術已經成為治療原發(fā)性膽道閉鎖、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、肝炎后肝硬化、酒精性肝病、肝細胞性肝癌、自身免疫性肝病、急性肝功能衰竭以及藥物誘導的肝臟損傷等疾病，挽救晚期肝病患者生命的最有效方法。 特點： HLA是否匹配與肝臟移植效果無顯著差異機制：肝臟移植時，因HLA不配僅發(fā)生較弱的排斥反應，而免疫抑制劑的應用有效控制了排斥反應的發(fā)生肝臟移植時仍應盡可能進行HLA配型1.組織配型在肝臟移植中的應用排斥反應發(fā)生幾率：約2/3的肝移植患者出現(xiàn)過排斥反應的病理學改變，也有8的病例術后發(fā)生急、慢性排斥反應，占肝移植致死原因的10%。2.肝移植受者的療效檢測

19、組織病理學特點：肝移植術后第2天，匯管區(qū)出現(xiàn)明顯的白細胞浸潤，匯管區(qū)和肝竇的白細胞浸潤第7天達高峰，涉及到T細胞、B細胞、巨噬細胞、嗜酸性和中性粒細胞。在浸潤的T細胞中CD8+細胞高于CD4+細胞，也見有IL-2R和CD25+的活化T細胞。三、心臟移植與心肺聯(lián)合移植 在世界范圍內，約有300多個心臟中心進行心臟移植，總例數已超過7萬，年病例不下3000，1年和5年存活率分別為80%和70%。心肺聯(lián)合移植已成為人們可以接受的治療終末期心肺疾病的一種有效方法。ABO血型匹配：避免急性排斥反應的首要條件。HLA I、類分子匹配：移植器官長期存活的重 要因素。 淋巴細胞毒交叉配合和群體反應性抗體檢測1

20、.組織配型在心臟和心肺聯(lián)合移植中的應用 外周血淋巴細胞總數 T、B細胞的轉化能力 T細胞亞類百分數及比值 CTL細胞毒作用 細胞因子及其受體表達或轉錄水平 轉化生長因子 NK細胞數及其介導的自然殺傷或ADCC效應 粘附分子及其配體在各類細胞表達情況2.心臟及心肺聯(lián)合移植受者的療效檢測 免疫監(jiān)測指標 骨髓和干細胞移植均系非實質性器官移植，其中骨髓移植開展的較早，而干細胞移植正日益受到臨床工作者的重視。 四、骨髓與其他來源的干細胞移植特點：可同時發(fā)生HVGR和GVHR 分類： 自體骨髓移植、 同基因骨髓移植 同種異基因骨髓移植（多見） 病例較少成功率高 骨髓移植實際上是造血干細胞移植，因此，骨髓中

21、造血干細胞的質和量對移植的成敗致關重要。 1.骨髓移植 方法：使用藥物動員劑促使造血干細胞從骨髓釋放到外周血，從中獲取足量的干細胞用于移植，可獲得與骨髓移植同樣的治療目的特點：與骨髓移植相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血恢復快，GVHR發(fā)生率和嚴重程度不高等優(yōu)點。 移植前檢測：HLA和ABO血型配型、血常規(guī)與骨髓檢驗、性染色體測定、造血干細胞鑒定和GVHR征象追蹤等腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)，提示人們在進行干細胞應用時應該注意生物安全性。2.外周血和臍血干細胞移植 第四節(jié) 排斥反應的種類及發(fā)生機制移植排斥反應（tranlplantation refection）是針對移植抗原產生免疫應答，從而

22、導致移植物功能喪失或受者機體損害的過程。 排斥反應分類： 超急性排斥反應 急性排斥反應 慢性排斥反應預防措施：ABO血型配型、交叉配型一、超急性排斥反應發(fā)生機制：受者體內存有抗供者移植物的預存抗體，與抗原結合，激活補體和凝血系統(tǒng),導致血管內凝血。預存抗體來源 ：1、供受者之間ABO 血型不合； 2、受者反復多次輸血、妊娠或既往作過移植處理措施：重新移植發(fā)生時間：血循環(huán)恢復后的數分鐘至12天內分類：急性體液性排斥反應：抗體激活補體，并有CD4+T細胞參與，導致急性血管炎急性細胞性排斥反應：CD8+CTL細胞的細胞毒作用、CD4+T和巨噬細胞的作用，導致急性間質炎。二、 急性排斥反應 發(fā)生時間：移

23、植后數周至數月內，是排斥反應最常見的類型 處理措施：使用免疫抑制劑 直接途徑（direct path）:殘留于供者移植物內的抗原提呈細胞（過客細胞）對受者機體的免疫系統(tǒng)提供最初的抗原刺激。這種抗原性刺激，來自移植物中樹突狀細胞和單核細胞等表面富含的HLA-、-類分子 間接途徑 （indirect path）:通過受者體內的抗原提呈細胞對具有同種異基因HLA-、-類分子的移植物實質細胞的識別。無論是供者還是受者，其抗原提呈細胞提供的IL-1、IL-6等刺激信號，有助于觸發(fā)淋巴細胞的活化 急性排斥反應中的兩條抗原提呈途徑同種移植排斥反應的發(fā)生機制三、慢性排斥反應發(fā)生時間：一般發(fā)生于移植后數月甚至數

24、年 臨床特征：對免疫抑制療法不敏感無特異性治療方法，最終需要重新進行器官移植 病理特點：血管壁細胞浸潤、間質纖維化和瘢痕形成T細胞、巨噬細胞等介導的遲發(fā)型超敏反應等免疫損傷。B細胞產生的抗體活化補體或通過ADCC破壞血管內皮細胞。急性排斥反應反復發(fā)作所導致的移植物組織退行性變，此與細胞和體液免疫均有關系。非免疫相關因素，諸如局部缺血、再灌注損傷、微生物感染等。受者患有高血壓或糖尿病也可促使慢性排斥反應的發(fā)生引起慢性排斥反應的因素定義：在骨髓移植時，供者骨髓中的免疫細胞啟動以受者細胞為靶抗原的免疫應答反應，引起攻擊受者的移植物抗宿主反應。GVHD也可見于脾、胸腺和小腸移植。 四、移植物抗宿主反應

25、發(fā)生機制：T細胞起主要作用 IL-2、IL-6、TNF-、IFN-等細胞因子參與 ICAM、VCAM、CD44、ELAM-1等粘附分子參與第五節(jié) 排斥反應的免疫監(jiān)測 排斥反應發(fā)生時，受者體內的免疫應答將發(fā)生一系列變化，據此，檢測機體的免疫狀態(tài)可幫助診斷或推測排斥反應的發(fā)生。一、體液免疫與細胞免疫水平檢測的臨床意義 特異性抗體水平的檢測 相關免疫指標： ABO等血型和HLA抗體 抗供者組織細胞抗體 血管內皮細胞抗體 冷凝集素 測定方法: 交叉配型、補體依賴的細胞毒性試驗 血清PRA水平:判斷器官移植時受體對移植物的敏感程度， 基于細胞毒性試驗的PRA測定，被作為心臟移植前的常規(guī)項目， 若PRA超

26、過5，則應進行供者淋巴細胞與受者血清的交叉配型。（一）體液免疫水平檢測的臨床意義補體水平的檢測補體活性與急性移植排斥反應的發(fā)生有關當移植物遭受排斥時，補體成分的消耗增加可采用溶血法或比濁法進行檢測。補體活性的檢測補體的裂解產物，如C3a、C3b、C3d等的測定常用的檢測方法有免疫電泳、免疫標記技術 （二）細胞免疫水平檢測的臨床意義外周血T細胞及其亞類的計數 CD4/CD8比值大于1.20時:預示急性排斥即將發(fā)生， CD4/CD8比值小于1.08時:發(fā)生感染的可能性很大。 若進行動態(tài)監(jiān)測，對急性排斥反應和感染具有鑒別診斷的意義NK細胞活性測定混合淋巴細胞反應:刺激細胞:滅活的供者的淋巴細胞 反應

27、細胞:受者淋巴細胞 結果顯示的是CTL和NK細胞共同作用的結果。 動態(tài)監(jiān)測NK細胞活性則意義更大血清細胞細胞因子測定 IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-等細胞因子的水平均可升高 個體間血清IL-2R的含量差別顯著粘附分子及其配體的檢測免疫細胞以及血管內皮細胞等細胞膜表面粘附分子及其配體的表達，與急性排斥反應的發(fā)生密切相關。諸如ELAM-1、VCAM、ICAM和HLA分子等比較受者接受移植物前后的細胞因子水平環(huán)孢霉素A具有腎毒性，血清肌酐值增高，而IL-2R卻明顯降低血清肌酐值和IL-2R同時增高提示急性排斥反應的發(fā)生巨細胞病毒感染時，IL-2R血清含量的升高將更為明顯二、尿微量蛋白檢測的臨床意義 尿微量蛋白檢測意義： 判斷大器官移植、尤其是腎臟移植時排斥反應的發(fā)生 檢測免疫抑制藥的肝腎毒副作用 1-微球蛋白是能較早反映腎功能損害的指標 尿-1微球蛋白和尿IgG與腎移植受者短期腎功能關系密切尿微量蛋白種類： 血漿蛋白：包括白蛋白（Aib）、IgG、IgA、IgM、輕鏈（）、2-微球蛋白（2M）、補體C3、1微球蛋白（1M）、2巨球蛋白（2M）、轉鐵蛋白（TRF）、游離血紅蛋白（Hb）、肌紅蛋白（Mb）及其他血漿蛋白和酶 非血漿蛋白：腎臟的Tamm-Horsfall蛋白（THP）、SIgA、腎小球基底膜（GBM）抗原等三、急性時相反應物質檢測的臨床意義 C反應