1、依折麥布對兔動脈粥樣硬化作用的實(shí)驗(yàn)研究【關(guān)鍵詞】動脈粥樣硬化;脂質(zhì)蓄積;蛋白激酶;依折麥布1材料與方法1.3實(shí)驗(yàn)步驟對照組喂普通飼料，模型組喂高膽固醇飼料(高膽固醇飼料由普通飼料加2%膽固醇配制)，依折麥布干預(yù)組在高膽固醇飼料根底上參加5gkg-1d-1依折麥布，連續(xù)飼喂12，以鏡下見到內(nèi)膜增生和明顯的脂斑突起作為模型制備成功的標(biāo)志。1.4低密度脂蛋白的別離、氧化修飾及鑒定參照文獻(xiàn)3的方法制備低密度脂蛋白。取新穎人血漿100200l，參加PDB以防腐抗氧化，置超速離心機(jī)作序列超速離心。提純的LDL在含200l/LEDTA的磷酸緩沖液(PBS)中透析48h，BA法蛋白定量，uS4氧化，鑒定后過濾

2、除菌，調(diào)蛋白濃度至1g/L，4保存。1.5病理形態(tài)學(xué)分析頸總動脈放血處死動物，取出兔主動脈。PBS漂洗3次，用10%福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋、切片(厚度3)，HE染色觀察動脈粥樣硬化病變的形成。1.6主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及處理無菌條件下取兔主動脈，PBS沖洗35遍，剝?nèi)用}外膜，縱行剖開血管，小心刮去內(nèi)膜，用DE培養(yǎng)液沖洗一次。剪成13左右的組織塊，用彎頭接種針將組織塊移入25l培養(yǎng)瓶壁上，參加含20%小牛血清的DE培養(yǎng)液5l于對側(cè)瓶底，入培養(yǎng)箱孵育46h，然后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液蓋過組織塊。此后每3d換液一次。2左右可見VS貼壁長出，待原代細(xì)胞交融成致密單層時(shí)，用0.2

3、5%胰蛋白酶消化傳代，取47代VS用于實(shí)驗(yàn)或液氮中凍存。實(shí)驗(yàn)分為對照組(DE培養(yǎng)基24h)、xLDL處理組(用50g/lxLDL+DE培養(yǎng)基孵育24h)、依折麥布干預(yù)組(用50g/lxLDL+3l/L依折麥布+DE培養(yǎng)基孵育24h)。1.7油紅染色將主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，按照主動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法處理24h后吸棄舊的培養(yǎng)基，用PBS液沖洗3次，每次5in;50%異丙醇固定1in，油紅染色10in，蘇木素襯染5in，鹽酸酒精分色;水性封片劑封片，顯微鏡觀察;細(xì)胞內(nèi)脂滴呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，圖像分析系統(tǒng)搜集圖像并于顯微鏡下攝像保存。參照文獻(xiàn)4方法進(jìn)展脂滴染色的半定

4、量分析，即根據(jù)細(xì)胞脂滴的面積進(jìn)展細(xì)胞分類。細(xì)胞脂滴的面積小于細(xì)胞核的面積記為“-;細(xì)胞脂滴的面積等于或大于細(xì)胞核的面積記為“+即為油紅染色細(xì)胞。每塊玻片計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.8高效液相色譜分析將經(jīng)過處理的平滑肌細(xì)胞吸棄舊培養(yǎng)基，PBS洗2次，參加1l0.9%Nal溶液，細(xì)胞刮子搜集細(xì)胞。冰浴中超聲破碎細(xì)胞;BA法測定蛋白含量。參照文獻(xiàn)5方法進(jìn)展高效液相色譜(highperfraneliquidhratgraphy，HPL)分析。采用18柱以異丙醇:正庚烷:乙晴為流動相進(jìn)展非梯度洗脫，流速1l/in，柱溫保持4，216n檢測8in。以峰面積定量游離膽固醇(F)和膽固醇酯(E

5、)，總膽固醇(T)量為游離膽固醇量加上膽固醇酯的量。1.9PepTagRAssay將處理后的平滑肌細(xì)胞提取胞漿胞膜蛋白，BA蛋白檢測試劑盒定量后參照文獻(xiàn)6方法進(jìn)展PepTagRAssay操作。可見/紫外分光光度計(jì)讀取570n的吸光度值，以液化的不含PepTagRPeptide的瓊脂糖作為空白值。根據(jù)試劑盒提供的數(shù)據(jù)和Beers定律A=B(A樣品吸光度;肽的摩爾吸收率Ll-1-1;B比色杯寬度;樣品中肽濃度l/L)逐步計(jì)算酶活性(1單位酶活性指每毫升溶液中的磷酸鹽每分鐘轉(zhuǎn)移至底物的納摩爾數(shù)量)。1.11estern免疫印跡檢測將提取的細(xì)胞胞膜蛋白BA蛋白定量并煮沸變性后，參照文獻(xiàn)6方法進(jìn)展ABA

6、1、PK和內(nèi)參照GAPDH的蛋白免疫印跡檢測。蛋白條帶采用UVP凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以各組目的蛋白與內(nèi)參照蛋白吸光度值的比值比擬待測蛋白的表達(dá)差異。1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)采用xs表示，組間比擬采用方差分析及t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件分析。2結(jié)果2.1依折麥布對新西蘭兔動脈粥樣硬化的影響主動脈石蠟切片HE染色顯示，飼喂12后對照組主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完好，中膜主要由呈波浪狀同心排列的彈性纖維膜構(gòu)成，基質(zhì)內(nèi)可見環(huán)形的平滑肌細(xì)胞;模型組主動脈內(nèi)膜以及中膜顯著增厚，內(nèi)皮下間隙蓄積了大量的脂類物質(zhì)和壞死性物質(zhì)，中膜彈性纖維層構(gòu)造不清，細(xì)胞排列紊亂;與模型組比擬，依折麥布干預(yù)組主動脈

7、內(nèi)膜和中膜明顯變薄，內(nèi)皮下間隙蓄積物質(zhì)減少，但仍有蓄積，中膜構(gòu)造也漸趨好轉(zhuǎn)(圖1)。提示依折麥布可以抑制或者逆轉(zhuǎn)高膽固醇飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化。圖1依折麥布對新西蘭兔動脈粥樣硬化的影響(HE，400)2.2依折麥布對新西蘭兔主動脈平滑肌細(xì)胞泡沫化過程的影響主動脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)并傳47代后應(yīng)用50g/lxLDL或50g/lxLDL+3l/L依折麥布處理24h后，油紅染色顯示細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅染的小球狀脂滴(圖2)。脂滴半定量分析結(jié)果顯示，對照組、xLDL處理組和依折麥布干預(yù)組油紅染色細(xì)胞分別為(132)、(689)、(314)個(gè)。與xLDL處理組比擬依折麥布干預(yù)組油紅染色細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.0

8、5)。高效液相色譜分析顯示，50g/lxLDL處理24h后主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)E與T比值高達(dá)57.1%，已經(jīng)演變?yōu)槠交≡葱耘菽?xì)胞;而依折麥布干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)E和T顯著下調(diào)，E/T下降至39.6%。提示依折麥布可以減少主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯和脂滴的蓄積，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成(表1)。胞膜PK表達(dá)的影響2.4依折麥布對新西蘭兔主動脈平滑肌細(xì)胞膜PK活性和PK表達(dá)的影響對照組、xLDL處理組和依折麥布干預(yù)組新西蘭兔主動脈平滑肌細(xì)胞胞膜PK活性依次為(0.3110.032)、(0.9750.081)、(0.4250.062)U/l，組間比擬差異顯著(P0.05)。estern蛋白印跡分析顯示，與xLDL處理組比擬，依折麥布干預(yù)組平滑肌細(xì)胞胞膜PK表達(dá)下調(diào)(圖4，表2)。提示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶PK也受到了膽