1、ICS 65.020.01B 04DB12天津市地方標準DB12/T 5042014水稻轉基因成分篩查方法Screening method for genetically modified rice2014-04-22 發(fā)布2014-07-20 實施天津市質量技術監(jiān)督局發(fā)布DB12/T 50420141前言本標準按照GB/T 1.12009 給出的規(guī)則起草。本標準由天津市質量技術監(jiān)督局提出。本標準起草單位：天津市東麗區(qū)產品質量監(jiān)督檢驗所、天津市農業(yè)質量標準與檢測技術研究所。本標準主要起草人：黃鳳軍、朱珠、易萌、楊炳存、劉文、趙新、李陽、閆榮卿。本標準 2014 年 04 月首次發(fā)布。水稻轉基因

2、成分篩查方法范圍本標準規(guī)定了水稻中轉基因成分定性 PCR 篩查的術語和定義、檢測方法、結果分析與表述。本標準適用于水稻及其制品中 SPS 基因、CaMV35S 啟動子、NOS 終止子、Bt 基因、NPTII 基因和HPT 基因的定性 PCR 篩查檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T 672轉基因植物及其產品檢測通用要求農業(yè)部 1485 號公告42010轉基因植物及其產品成分檢測DNA 提取和純化農業(yè)部

3、2031 號公告192013轉基因植物及其產品檢測抽樣術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1SPS 基因SPS gene編碼蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase）的基因。3.2CaMV 35S 啟動子35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV）來自花椰菜花葉病毒的 35S 啟動子。3.3NOS 終止子 terminator of nopaline synthase （NOS） gene來自胭脂堿合成酶基因 NOS 的終止子。3.4Bt 基因Bt（Bacillus thuringiensis）gene來源與

4、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt），可表達一種殺蟲晶體蛋白的基因，常見的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。3.5NPTII 基因NPTII gene來源于大腸桿菌（Escherichia coli），編碼新霉素磷酸轉移酶（neomycin phosphotransferase）的基因。3.6HPT 基因HPT gene來自大腸桿菌或鏈球菌（ Streptomyceshy groscopicus ），編碼潮霉素磷酸轉移酶（ hygromycin phosphotransferase）的基因。 PAGE 7檢測方

5、法試劑和材料實驗用水為重蒸餾水或符合 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。瓊脂糖。10 g/L 溴化乙錠溶液：稱取 1.0 g 溴化乙錠（EB），溶于 100 mL 水中，避光保存。注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時應戴一次性手套操作并妥善處理廢液。10 mol/L 氫氧化鈉溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氫氧化鈉（NaOH），溶解后再加水定容到 200 mL。500 mmol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH 8.0）：稱取 18.6 g 乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2）， 加入 70 mL 水中，再加入適量氫氧化鈉溶液（4.1.4），加熱至完全溶解后，冷卻至室溫，用氫氧化

6、鈉溶液（4.1.4）調 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121 ）條件下滅菌 20 min。1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（pH 8.0）：稱取 121.1 g 三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于 800 mL 水中，用鹽酸調 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kP（a 121 ）條件下滅菌 20 min。TE 緩沖液（pH 8.0）：分別量取 10 mL 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（4.1.6）和 2 mL 乙二銨四乙酸二鈉溶液（4.1.5），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ）條件下滅

7、菌 20 min。50TAE 緩沖液：稱取 242.2 g 三羥甲基氨基甲烷（Tris），先用 300 mL 水加熱攪拌溶解后， 加 100 mL 乙二銨四乙酸二鈉溶液（4.1.5），用冰乙酸調 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用時用水稀釋成 1TAE。加樣緩沖液：稱取 250.0 mg 溴酚藍，加 10 mL 水，在室溫下溶解 12 h；稱取 250.0 mg 二甲基苯腈藍，用 10 mL 水溶解；稱取 50.0 g 蔗糖，用 30 mL 水溶解?；旌弦陨先N溶液，加水定容至 100 mL， 在 4 下保存。DNA 分子量標準：可以清楚的區(qū)分 50 bp1 000 bp

8、 的 DNA 片段。dNTPs 混合溶液：將濃度為 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合。Taq DNA 聚合酶、PCR 反應緩沖液及 25 mmol/L 氯化鎂溶液。引物：水稻內標準基因和轉基因水稻外源基因檢測時所用的引物序列見表 1。表 1 水稻內標準基因和轉基因水稻外源基因引物序列檢測基因引物序列擴增片段長度基因性質SPSSPS -F： 5-ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC-3SPS -R： 5-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3287 bp內標準基因CaMV 35S35S -F：5-GCT

9、CCTACAAATGCCATCATTGC-335S -R：5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3195 bp外源基因NOSNOS -F：5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3NOS -R：5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3180 bp外源基因BtBt -F：5- GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC -3Bt -R：5- CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3301 bp外源基因NPTIINpt-F：5- ACTGGGCACAACAGACAATCG -3Npt-R：5- GCATCAGCCATGATGGATACTTT -3289 bp外源

10、基因HPThpt -F：5- GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT -3hpt -R：5- AGATGTTGGCGACCTCGTATT -3472 bp外源基因引物溶液：用 TE 緩沖液（4.1.7）或水分別將上述引物稀釋到 10 mol/L。石蠟油。PCR 產物回收試劑盒。DNA 提取試劑盒。儀器分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。PCR 擴增儀：升降溫速度1.5 /s，孔間溫度差異1.0 。電泳槽、電泳儀等電泳裝置。紫外透射儀。凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。重蒸餾水發(fā)生器或純水儀。其他相關儀器設備。分析步驟抽樣按 NY/T 672 和農業(yè)部 2031 號公告192013 規(guī)定的

11、執(zhí)行。試樣準備按 NY/T 672 和農業(yè)部 2031 號公告192013 規(guī)定的執(zhí)行。試樣預處理按農業(yè)部 1485 號公告42010 規(guī)定的執(zhí)行。DNA 模板制備按農業(yè)部 1485 號公告42010 規(guī)定的執(zhí)行。PCR 反應試樣 PCR 反應每個試樣 PCR 反應設置 3 次重復。在 PCR 反應管中按表 2 依次加入反應試劑，混勻，再加 25 L 石蠟油（有熱蓋設備的 PCR儀可不加）。表 2 PCR 檢測反應體系試劑終濃度體積水10PCR 緩沖液12.5 L25 mmol/L 氯化鎂溶液1.5 mmol/L1.5 LdNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）各 0.2 mmol/L

12、2.0 L10 mol/L 正向引物0.20.5 mol/L0.52.5L10 mol/L 反向引物0.20.5mol/L0.52.5LTaq 酶0.025 U/L25 mg/L DNA 模板2 mg/L2.0 L總體積25.0 L根據Taq 酶的濃度確定其體積，并相應調整水的體積，使反應體系總體積達到 25.0 L。如果PCR 緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，加等體積水。注：SPS 基因PCR 檢測反應體系中，上下游引物分別是SPS-F1 和SPS-R，引物終濃度分別為 0.2mol/L； CaMV35S 啟動子PCR 檢測反應體系中，上下游引物分別是 35S-F 和 35S-R，引物

13、終濃度分別為 0.4mol/L；NOS 終止子PCR 檢測反應體系中，上下游引物分別是 NOS-F 和NOS-R，引物終濃度分別為 0.4mol/L；Bt 基因PCR 檢測反應體系中，上下游引物分別是Bt-F 和Bt-R，引物終濃度分別為 0.5mol/L；NPTII 基因PCR 檢測反應體系中，上下游引物分別是 Npt-F 和 Npt-R，引物終濃度分別為 0.2mol/L；HPT 基因 PCR 檢測反應體系中，上下游引物分別是hpt-F 和hpt-R，引物終濃度分別為 0.2mol/L。將 PCR 管放在離心機上，500 g3 000 g 離心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR

14、 擴增儀中。進行 PCR 反應。反應程序按表 3 進行。表 3 PCR 反應程序被擴增的基因變性擴增循環(huán)次數(shù)最終延伸SPS94 ，5 min94，30s58，30s72，30s3572 ，2 minCaMV35S94 ，5 min94 ，30 s60 ，30 s72 ，30 s3572 ，7 minNOS94 ，5 min94 ，30 s60 ，30 s72 ，30 s3572 ，7 minBt95 ，5 min94 ，1 min56 ，30 s72 ，30 s3572 ，7 minNPTII94 ，5 min94 ，30 s60 ，30 s72 ，30 s3572 ，7 minHPT94 ，

15、5 min94 ，30 s60 ，30 s72 ，30 s3572 ，7 min反應結束后取出 PCR 管，對 PCR 反應產物進行電泳檢測。對照 PCR 反應在試樣 PCR 反應的同時，應設置陰性對照、陽性對照和空白對照。以非轉基因水稻基因組 DNA 作為陰性對照；以含有 SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT 基因的轉基因水稻質量分數(shù)為 0.1%1.0%的基因組DNA 作為陽性對照；以水作為空白對照。各對照 PCR 反應體系中，除模板外，其余組分及 PCR 反應條件與 7.5.1 相同。PCR 產物電泳檢測按 20 g/L 的質量濃度稱量瓊脂糖，加入 1TAE 緩沖液中，

16、加熱溶解，配制成瓊脂糖溶液。每 100 mL 瓊脂糖溶液中加入 5 L EB 溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝固成凝膠后，放入 1TAE 緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取 12 L PCR 產物與 3 L 加樣緩沖液混合后加入凝膠點樣孔，同時在其中一個點樣孔中加入DNA 分子量標準，接通電源在 2 V/cm5 V/cm 條件下電泳檢測。凝膠成像分析電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀上成像。根據 DNA 分子量標準估計擴增條帶的大小，將電泳結果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。如需通過序列分析確認 PCR 擴增片段是否為目的DNA 片段，按照

17、4.3.8 和 4.3.9 的規(guī)定執(zhí)行。PCR 產物回收按 PCR 產物回收試劑盒說明書，回收 PCR 擴增的DNA 片段。PCR 產物測序驗證將回收的 PCR 產物克隆測序，與水稻 SPS、CaMV35S、NOS、Bt、NPTII、HPT 基因序列（參見附錄 A）進行比對，確定 PCR 擴增的 DNA 片段是否為目的 DNA 片段。結果分析與表述對照檢測結果分析陽性對照的 PCR 反應中，內標準基因和外源基因均得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，而在陰性對照中僅擴增出內標準基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明 PCR 反應體系正常。否則表明 PCR 反應體系不正常，需要查找原因

18、重新檢測。樣品檢測結果分析和表述在試樣的 PCR 反應中，內標準基因得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致；而 SPS 基因、CaMV35S 啟動子、NOS 終止子、Bt 基因、NPTII 基因和 HPT 基因均未得到擴增，或擴增片段大小與預期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出轉基因成分。結果表述為“試樣中未檢測出 CaMV35S 啟動子、NOS 終止子、Bt 基因、NPTII 基因和 HPT 基因，檢測結果為陰性”。在試樣的 PCR 反應中，內標準基因得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致； CaMV35S 啟動子、NOS 終止子、Bt 基因、NPTII 基因和 HPT 基因中任何一

19、個得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，表明試樣中檢測出轉基因成分。結果表述為“試樣中檢測出 XXX，檢測結果為陽性”。附錄 A（資料性附錄）SPS 基因PCR擴增產物核苷酸序列1ATCTGTTTAC TCGTCAAGTG TCATCTCCTG AAGTGGACTG GAGCTATGGG GAGCCTACTG61AAATGTTAAC TCCGGTTCCA CTGACGGAGA GGGAAGCGGT GAGAGTGCTG GTGCGTACAT121TGTGCGCATT CCGTGCGGTC CAAGGGACAA GTACCTCCGT AAAGAGCCCT GTGGCCTTAC181CTCC

20、AAGAGT TTGTCGACGG AGCTCTCGCG CATATCTGAA CATGTCCAAG GCTCTGGGGG241AACAGGTTAG CAATGGGAAG CTGGTCTTGC CATATGTAAT CCATGGC注：劃線部分為引物序列CaMV 35S啟動子PCR擴增產物核苷酸序列1GCTCCTACAA ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCTAT CATTCAAGAT GCCTCTGCCG61ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC121CAACCACGTC TTCA

21、AAGCAA GTGGATTGAT GTGATACTTC CACTGACGTA AGGGATGACG181CACAATCCCA CTATC注：劃線部分為引物序列NOS終止子PCR擴增產物核苷酸序列1GAA TCCTGTTGCC GGTCTTGCGA61TGATTATCAT ATAATTTCTG TTGAATTACG TTAAGCATGT AATAATTAAC ATGTAATGCA121TGACGTTATT TATGAGATGG GTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTATAC ATTTAATACG181CGATAGAAAA CAAAATATAG CGCGCAAACT AGGAT

22、AA注：劃線部分為引物序列Bt基因PCR擴增產物核苷酸序列1GAAGGTTTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT61CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCGCC121TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGTC CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG181TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA241AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATC301G注：劃線部分為引物序列NPTII基因PCR擴增產物核苷酸序列1ACTGGGCACA ACAGACAATC GGCTGCTCTG ATGCCGCCGT GTTCCGGCTG TCAGCGCAGG61GGCGCCCGGT TCTTTTTGTC AAGACCGACC TGTCCGGTGC CCTGAATGAA CTGCAGGACG121AG