1、丹參 APX和 GPX基因克隆及其表達(dá)分析正常情況下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡過(guò)程，少量的活性氧可作為逆境下信號(hào)分子參與植物的生理過(guò)程，大量的活性氧會(huì)對(duì)植物造成蛋白質(zhì)、膜脂、 DNA及其它細(xì)胞組分的嚴(yán)重氧化損傷。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中時(shí)常會(huì)受到不良環(huán)境的脅迫，如鹽漬、干旱、低溫等，其中鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)。植物在環(huán)境脅迫下體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，必須及時(shí)清除， 為了減少鹽分等脅迫造成的氧化損傷， 植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中， 形成了一套活性氧的清除保護(hù)機(jī)制，即植物體內(nèi)有效清除活性氧的酶促和非酶促系統(tǒng)。酶促系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶 (SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化酶 (APX)、過(guò)氧

2、化氫酶 (CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化酶 (GPX)等；非酶類抗氧化劑包括抗壞血酸(ASA)、還原型谷胱甘肽 (GSH)等。對(duì)植物體內(nèi)抗氧化保護(hù)酶基因的認(rèn)識(shí)有助于研究植物在逆境下的生理狀況并保護(hù)植物。本課題以丹參為研究對(duì)象，克隆了丹參抗壞血酸過(guò)氧化酶基因(SmaPX)和丹參谷胱甘肽過(guò)氧化酶基因(SmGPX)。利用生物信息學(xué)工具分析了兩個(gè)基因的核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列特征，并對(duì)其酶分子三維立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。對(duì)它們?cè)诘Ⅲw內(nèi)不同部位的表達(dá)以及鹽脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。構(gòu)建了 SmAPX和 SmGPX的原核表達(dá)載體并對(duì)其在大腸桿菌M15中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。主要實(shí)

3、驗(yàn)方法和結(jié)論如下： 1根據(jù)丹參 EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列，電子克隆得到 SmAPX基因全長(zhǎng)，并通過(guò)RT-PCR的方法獲得 SmAPX的 cDNA序列，該基因全長(zhǎng)為 758 bp ，包含一個(gè) 753 bp 的開放讀碼框，編碼250 個(gè)氨基酸。運(yùn)用生物信息學(xué)工具對(duì)丹參APX基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該基因的編碼產(chǎn)物是一不具跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析顯示 SmAPX在丹參根、莖、葉中均有表達(dá)，但根中表達(dá)量最低， 莖次之，葉中最高，葉片中的表達(dá)量為根中表達(dá)量的21 倍。對(duì) SmAPX基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著

4、鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)及鹽濃度的升高，該基因的表達(dá)量均升高。濃度為250 mM的鹽溶液脅迫 72 h 時(shí)， SmAPX的表達(dá)量為對(duì)照的2 倍，濃度為 200 mM的鹽溶液脅迫 48 h時(shí)， SmAPX表達(dá)量最高，比對(duì)照高7 倍。SmAPX在大腸桿菌 M15中表達(dá)一分子量約為27kD的蛋白，與預(yù)測(cè)的蛋白分子量一致，此外，SmAPX基因的表達(dá)在一定程度上可提高大腸桿菌的耐鹽性。2根據(jù)丹參 EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列， 電子克隆得到 SmGPX基因全長(zhǎng)，并通過(guò) RT-PCR的方法獲得 SmGPX的 cDNA序列，該基因全長(zhǎng)535 bp ，包含一個(gè) 501 bp 的開放讀碼框，編碼 166 個(gè)氨基酸。運(yùn)用生物

5、信息學(xué)工具對(duì)SmGPX的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該基因的編碼產(chǎn)物在翻譯后可能在12 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化修飾，是一不具跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性細(xì)胞質(zhì)型GPX。從其氨基酸序列所含的兩個(gè)磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化酶 (PHGPX)的特征序列并結(jié)合前述研究，推測(cè)所克隆到的是GPX家族的一特殊成員，即清除ROS保護(hù)生物膜免受氧化損傷的PHGPX。從 DNA水平也獲得該基因， Southern 結(jié)果表明 SmGPX以低拷貝形式存在于丹參基因組中。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析顯示 SmGPX在丹參根、莖、葉中均有表達(dá)，根中表達(dá)量最低， 葉片次之，莖中表達(dá)量最高， 莖中表達(dá)量為根中表達(dá)量的 6.78倍；鹽脅迫處理的丹參植株體內(nèi)SmGPX的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)穩(wěn)步升高，與對(duì)照相比，濃度為250 m