1、第五章 茶用酶工程第一節(jié) 概況第二節(jié) 酶的化學(xué)修飾第三節(jié) 酶的固定化第四節(jié) 細(xì)胞固定化第一節(jié) 概況一、酶工程定義 酶工程(enzyme engineering)是在1971年第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議上才得到命名的。定義： 利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。 二、酶工程發(fā)展形成的原因 天然酶在開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面受到限制： 1、酶的不穩(wěn)定性：高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿下不穩(wěn)定 2、易失活：即使在最適合的條件下反應(yīng) 3、酶的分離、純化較難，成本高，價(jià)格貴 4、經(jīng)濟(jì)上不合算：一次性反應(yīng)后不能再次使用，隨著 反應(yīng)時(shí)間的推移反應(yīng)速度減慢。 阻礙了微生物酶的應(yīng)用和發(fā)展 促進(jìn)了研制固定

2、化酶和固定化菌體三、酶工程研究?jī)?nèi)容 酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，主要研究： 酶的生產(chǎn)、純化、固定化技術(shù)、酶分子結(jié)構(gòu)的修飾和改造及其在工、農(nóng)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。 應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域三、酶工程研究?jī)?nèi)容 具體的有：（1）對(duì)生物寶庫(kù)中存在天然酶的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)；（2）自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)；（3）酶的固定化技術(shù)（酶和細(xì)胞固定化）；（4）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用；（5）與其他生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。 其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。有了酶的固定化技術(shù)，酶在工業(yè)生產(chǎn)中的利用價(jià)值才真正得以體現(xiàn)。四、酶工程在生物技術(shù)中的地位 是生物技術(shù)的四大支柱之一五、酶工程分類(lèi)化學(xué)酶

3、工程: 通過(guò)化學(xué)方法，對(duì)酶的化學(xué)修飾或固定化處理，改善酶的性質(zhì)以提高酶的效率和降低成本，甚至通過(guò)化學(xué)合成法制造人工酶； 生物酶工程: 用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶以及對(duì)酶基因進(jìn)行修飾或設(shè)計(jì)新基因，生產(chǎn)出性能穩(wěn)定，具有新的生物活性及催化效率更高的酶。 五、酶工程分類(lèi)1、化學(xué)酶工程 主要由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相互結(jié)合而形成，亦稱(chēng)初級(jí)酶工程，主要包括： 化學(xué)修飾 固定化處理 化學(xué)合成法改善酶的性質(zhì)、提高催化效率及降低成本自然酶化學(xué)修飾酶固定化酶 化學(xué)人工酶研究和應(yīng)用五、酶工程分類(lèi)1、化學(xué)酶工程天然酶：主要指工業(yè)用酶，從生物材料如微生物發(fā)酵中分 離純化得到的酶。如：洗滌劑、皮革生產(chǎn)中用的蛋白 酶；紙張制造用的淀

4、粉酶；乳制品用的凝乳酶等?；瘜W(xué)修飾酶：用于醫(yī)藥及研究工作。通過(guò) （1）化學(xué)修飾酶的功能基 ； （2）通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)； （3）大分子修飾作用（用葡萄糖修飾SOD增加其半 壽期，提高耐熱性、耐酸堿性等；用葡萄糖和 聚乙二醇修飾尿激酶等），從而改善酶的性能五、酶工程分類(lèi)1、化學(xué)酶工程固定化酶：將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，使之成為 不溶于水的，但仍具有酶活性的狀態(tài) 人工模擬酶：已知酶的活性中心和作用機(jī)理，用化學(xué)法 合成酶。五、酶工程分類(lèi)2、生物酶工程 是酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，也稱(chēng)為高級(jí)酶工程。1）克隆酶：用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（ -淀粉酶， 青 霉素酰胺酶、亮

5、氨酸合成酶）；2）突變酶：對(duì)酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶（改變 酶的催化活性、底物專(zhuān)一性、最適pH、改變 酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)能力、改變酶對(duì)輔酶的要求、 提高酶的穩(wěn)定性）；3）制造新酶：設(shè)計(jì)新酶基因，合成自然界不曾有的、能 穩(wěn)定和催化效率更高的新酶。五、酶工程分類(lèi)2、生物酶工程啟動(dòng)子 + 調(diào)整序列 + 酶的結(jié)構(gòu)基因克隆到載體上 受體菌中 培養(yǎng) 表達(dá)產(chǎn)物(酶)第二節(jié) 酶的化學(xué)修飾 通過(guò)化學(xué)合成來(lái)進(jìn)行酶的生產(chǎn)還是比較遙遠(yuǎn)的事情，但為適應(yīng)生產(chǎn)實(shí)踐的需要，可以通過(guò)化學(xué)和生物的方法以各種方式進(jìn)行酶的改造與模擬。一、酶的修飾內(nèi)容 有以下幾個(gè)方面： 1.是設(shè)法使酶的活性結(jié)構(gòu)加固，增加其穩(wěn)定性； 2.通過(guò)化學(xué)修飾或

6、酶法修飾改變酶的活性，其中包括某 些調(diào)節(jié)酶在修飾后對(duì)效應(yīng)物的反應(yīng)性能的改變； 3.設(shè)法消除免疫原性或抗原性以利于醫(yī)療應(yīng)用。第二節(jié) 酶的化學(xué)修飾二、增加酶的穩(wěn)定性1、酶失效的四種原因 （1）由于活性中心中特定的氨基酸被修飾； （2）外界因素引起了立體障礙； （3）酶蛋白變性引起高級(jí)結(jié)構(gòu)改變； （4）肽鏈被水解。二、增加酶的穩(wěn)定性2、增加酶的穩(wěn)定性的方法 （1）選擇相應(yīng)的產(chǎn)酶菌：如耐熱菌，耐酸、堿菌； （2）添加惰性蛋白、鹽類(lèi)、底物、輔酶等配體物質(zhì)，以 及某些有機(jī)溶劑，如多聚醇等，并在低溫下保存； （3）添加強(qiáng)度變性劑：目前還只是理論探索，其原理加入強(qiáng)度變性劑使酶分子變性徹底松散，在需要活性酶時(shí)移

7、去變性劑，使酶自然地恢復(fù)到活性結(jié)構(gòu)。 （4）化學(xué)修飾：特別是進(jìn)行分子內(nèi)、分子間交聯(lián)，使成活性結(jié)構(gòu)得到維持和加固，如用還原劑處理可以保持和恢復(fù)巰基酶的活性。三、酶的化學(xué)或酶法修飾1、修飾位置 化學(xué)修飾可以針對(duì)活性中心部位，也可以在活性中心以外的殘基上進(jìn)行，而且后者可行性一般更大。 但值得強(qiáng)調(diào)的是控制修飾條件十分重要，修飾后酶的活性可能上升，也可能下降，專(zhuān)一性以及對(duì)輔助因子的要求都可能改變。 例如；用乙基馬來(lái)酰亞胺修飾蘋(píng)果酸的SH基，可使其原有的脫羧酶活性與還原活性發(fā)生不同的變化。三、酶的化學(xué)或酶法修飾2、修飾方法 1）配基置換方法 將羧肽酶活性必需的鋅用鈷取代，結(jié)果肽酶活性和酯酶活性比完全改變。

8、 2）對(duì)酶有限制地水解 天門(mén)冬氨酸酶用胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶等水解，結(jié)果使該酶的活性高了約千倍。三、酶的化學(xué)或酶法修飾2、修飾方法 3）定向修飾 通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)將x衍射分析技術(shù)、蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象研究技術(shù)與基因工程技術(shù)結(jié)合在一起進(jìn)行的特定部位定向修飾，可以引入酶的預(yù)見(jiàn)性修飾與改造工作。 如將來(lái)源于枯草桿菌的酪氨酸t(yī)RNA合成酶的35位半胱氨酸換成甘氨酸后，可增強(qiáng)該酶對(duì)ATP的結(jié)合力。四、消除免疫原性或抗原性1、用小分子試劑進(jìn)行修飾 例如，用亞硝酸脫去天門(mén)冬氨酰胺酶N末端異亮氨酸的氮基與賴(lài)氨酸的氮基后，酶的活力不變，但它在體內(nèi)半壽期比天然酶長(zhǎng)兩倍，療效也顯著提高。2、用水溶性大分子修飾，特別是聚乙

9、二醇保護(hù)性修飾 例如，用聚乙二醇對(duì)尿酸酶修飾，可完全消除它的抗原性與免疫原性,減慢它們?cè)趧?dòng)物血液循環(huán)中的清除速度,修飾后酶的活力保存1545。 酶 修飾 原氨基酸 新氨基酸 酶性質(zhì) 部位 殘基 殘基 的改變酪氨酰- 51 蘇 丙 對(duì)底ATP的親合力tRNA合成酶 51 蘇 脯 提高100倍-內(nèi)酰胺酶 70-71 絲蘇 蘇絲 完全失活 70-71 蘇絲 絲絲二氫葉酸 27 天冬 天胺 活性降低正常還原酶 酶的0.1% 酶的選擇性修飾第三節(jié) 酶的固定化一、固定化酶的概念 水溶性酶通過(guò)物理和化學(xué)的方法，使之與不溶性載體結(jié)合形成的一種不再溶解的酶，是化學(xué)酶工程中具有強(qiáng)大生命力的主干。水溶性酶水不溶性載

10、體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)二、固定化酶的來(lái)歷 是1971年在美國(guó)舉行的第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議上正式推薦確定的，又稱(chēng)水不溶性酶、固相酶。1950s開(kāi)始：將聚氨基苯乙烯樹(shù)脂重氮化，再與羧 肽酸、淀粉酶等結(jié)合制成最早的固定 化酶1969年： 用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸。 第一個(gè)工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。 目前，我國(guó)利用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸； 固定化的葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖玉米糖漿三、制備固定化酶遵循基本原則 （1）必須注意維持酶的催化活性及專(zhuān)一性；（2）固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化；（3）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與 底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量；（4）酶與

11、載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯 藏，利于重復(fù)使用；（5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、 產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（6）固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。四、酶的固定化方法 1）物理方法 （1）吸附法 （2）包埋法 1 物理吸附法2 包埋法3 微型膠囊法4 凝膠格子型5 空心纖維型6 纖維絲型123456四、酶的固定化方法 2）化學(xué)方法 （1）共價(jià)偶聯(lián)法 （2）交聯(lián)法 1 離子結(jié)合法2 交聯(lián)法3 載體結(jié)合法4 架橋法5 網(wǎng)絡(luò)結(jié)合6 酶網(wǎng)共價(jià)鍵結(jié)合法123456四、酶的固定化方法 3）物理化學(xué)方法 （1）架橋、包埋結(jié)合法 （2）包埋與離子結(jié)合法 （3）共價(jià)結(jié)合包埋法1 架

12、橋、包埋結(jié)合法；2 包埋與離子結(jié)合法；3 共價(jià)結(jié)合包埋法123化學(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶 不同固定化酶的制法比較特性制備方法共價(jià)鍵結(jié)合法離子結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法包埋法制法難易難易難酶活力高高中低高底物特異性易變不變易變不變不變結(jié)合能力弱中強(qiáng)弱弱再生不可可能不可可能不可五、固定化酶的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）不溶于水，用離心法或過(guò)濾法易于與產(chǎn)物分離；（2）可反復(fù)使用,節(jié)約成本；（3）可連續(xù)化生產(chǎn)（反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)）（4）穩(wěn)定性好：對(duì)酸堿和溫度； （5）酶反應(yīng)過(guò)程能加以嚴(yán)格控制，更適合于多酶反應(yīng)缺點(diǎn)：固定化過(guò)程中往往會(huì)引起酶的失活六、制備固定化酶時(shí)應(yīng)注意

13、（1）保護(hù)酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)不變。（2）避免不溶性載體與酶的活性中心發(fā)生作用（3）在溫和條件下進(jìn)行，避免高溫、高壓、強(qiáng)酸堿等（4）固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)與野生型的會(huì)不相同。七、固定化酶的應(yīng)用1、固定化酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸 乙酰 -D Ala Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala七、固定化酶的應(yīng)用2、固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用 游離酶注射入人體以后一般會(huì)產(chǎn)生三個(gè)問(wèn)題： （1）酶作為異體物質(zhì)，反復(fù)應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)； （2）酶是蛋白質(zhì)，在體

14、內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移出和被蛋白酶水解破壞； （3）由于稀釋效應(yīng)，藥物酶無(wú)法集中于靶器官組織以達(dá)到最適治療所需要的高濃度。 這些缺點(diǎn)，通過(guò)選擇適宜的載體與方法將藥物酶固定化以后就能逐一地加以解決。七、固定化酶的應(yīng)用3、固定化酶在分析化學(xué)中的應(yīng)用 固定化酶在生化分析和臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用是一個(gè)十分重要的領(lǐng)域，它的發(fā)展非常迅速。這不僅僅因?yàn)樗鼈儽容^穩(wěn)定，可反復(fù)使用，能實(shí)行自動(dòng)化、連續(xù)化；而且因?yàn)樗鼈儗?duì)抑制劑和活化劑比較不敏感，從而可用于較復(fù)雜體系的檢測(cè)。 分析化驗(yàn)中應(yīng)用的固定化酶可大體分為兩種類(lèi)型： 酶?jìng)鞲衅骱凸潭ɑ钢鶛z測(cè)器。酶?jìng)鞲衅鳎河晒潭ɑ负湍芰哭D(zhuǎn)換器（電極、場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)管等）密切結(jié)

15、合組成的傳感裝置，是生物傳感器的一種。酶電極葡萄糖氧化酶電極 固定化酶膜 氧電極 葡萄糖氧化酶電極 高分子薄膜七、固定化酶的應(yīng)用3、固定化酶在分析化學(xué)中的應(yīng)用 酶電極（1）葡萄糖電極半透膜酶膠層感應(yīng)電極酶電極示意圖D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5內(nèi)酯H2O（2）脲電極Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶產(chǎn)生的2NH4+為陽(yáng)離子電極感應(yīng)。此外還有：氨基酸電極醇電極尿酸電極乳酸電極青霉素電極亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3第四節(jié) 細(xì)胞固定化一、細(xì)胞固定化的概念定義：通過(guò)各種方法將細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合，制備固 定化細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞固定化。優(yōu)點(diǎn)：不需提制酶，可保持酶的活性。反

16、復(fù)使用，成 本低與固定化酶比較第四節(jié) 細(xì)胞固定化二、細(xì)胞固定化的種類(lèi) 1.微生物細(xì)胞固定化 2.植物細(xì)胞固定化 3.動(dòng)物細(xì)胞固定化 4.原生質(zhì)體固定化三、細(xì)胞固定化的方法制備方法：與固定化酶相同，有包埋法、載體結(jié)合法 、 交聯(lián)法、熱處理法、射線(xiàn)處理法。 其中包埋法是最理想的方法。1.包埋 這是固定細(xì)胞最主要的方法。1）原理 在菌體細(xì)胞本身不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的情況下，將其包進(jìn)半透性的多聚物膜內(nèi)。小分子的底物和產(chǎn)物均可自由出入，而菌體細(xì)胞卻不會(huì)漏出。三、細(xì)胞固定化的方法1.包埋 2）方法 常用的包埋材料是：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、瓊脂 以制備含天門(mén)冬氨酸的大腸桿菌細(xì)胞為例： 將菌體細(xì)胞預(yù)先用生理鹽水懸浮

17、，向懸浮液中加入聚丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，然后加入催化劑過(guò)硫酸胺和加速劑四甲基乙二胺，混勻后放置一定時(shí)間聚合。將得到的凝膠破碎即得到固定化細(xì)胞。收率達(dá)72.5包埋法制備固定化菌體應(yīng)用舉例包埋材料菌種酶系用途 瓊脂大腸桿菌大腸桿菌谷氨酸脫羧酶青霉素酰胺酶制造-酪蛋白 生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸(6-APA)明膠戊二醛短乳桿菌鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶從葡萄糖生產(chǎn)高果糖漿聚丙烯酰胺大腸桿菌天門(mén)冬氨酸酶醋酸纖維素大腸桿菌青霉素酰胺酶（裂解）青霉素酰胺酶（合成）生產(chǎn)6APA生產(chǎn)半合成青霉素三、細(xì)胞固定化的方法2、載體結(jié)合法（吸附法） 固定化動(dòng)植物細(xì)胞的主要方式，但是難于大規(guī)模生產(chǎn)1）原理 微生物細(xì)胞表面帶有電荷，在適當(dāng)?shù)臈l件下可以 與載體的離子交換基團(tuán)形成絡(luò)合物或吸附在載體上。2）常用載體 離子交換纖維素。陰離子樹(shù)脂、DEAE纖維素。3）優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、載體易于再生。 缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，菌體細(xì)胞