1、第三章 基因操作的工具酶3.1 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease） “限制性核酸內(nèi)切酶” ：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并將DNA雙鏈結(jié)構(gòu)切開(kāi)的核酸內(nèi)切酶。它們主要是從原核生物中分離純化到的。 限制性核酸內(nèi)切酶：切割DNA，降解入侵細(xì)胞的外源DNA，提供了特殊的重組機(jī)會(huì)和保衛(wèi)種的穩(wěn)定。 DNA 甲 基 化 酶：修飾DNA（modification），具有種屬專一性，通常只修飾宿主本身的DNA，保護(hù)其免受降解。 限制酶和甲基化酶對(duì)DNA底物有相同的識(shí)別序列。 3.1.1 分類和命名分類 ：三類酶均能識(shí)別DNA分子中特定的核苷酸序列 I 型

2、 酶：既有內(nèi)切酶活性，又有甲基化酶活性（限制-修飾功能）；對(duì)DNA序列的切割是隨機(jī)的 II 型酶：核酸內(nèi)切酶活性和甲基化酶活性是分開(kāi)的；切割位點(diǎn)固定，就在特異序列處（在分子克隆中十分有用） III型酶：也具有限制-修飾功能；切割位點(diǎn)距特異序列3-端有2426 bp的誤差命名 ：(1) 取屬名的第一個(gè)字母（大寫）、種名的前兩個(gè)字母（小寫）組成3個(gè)字母的略語(yǔ)，表示產(chǎn)生菌的物種名稱(2) 用羅馬數(shù)字表示分離到的酶的編號(hào)，有時(shí)在字母和羅馬數(shù)字之間還加上一個(gè)字母表示菌株的名稱（也可以沒(méi)有）e.g.：從大腸桿菌RY 13菌株（Escherichia coli RY13）中分離到的第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶，稱

3、為EcoR I3.1.2 II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征 基本特征： (1) 作用于雙鏈DNA分子 (2) 能夠識(shí)別由48個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列識(shí)別序列 或 靶序列 靶序列具有回文結(jié)構(gòu)，也稱雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu) 如： 或 N代表任意一種核苷酸(3) 切割靶序列形成粘性末端或平末端 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，結(jié)果形成具有平末端的DNA片段。 如Sma I識(shí)別的靶序列為： 切割后形成： 兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)的，但對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段。 “粘性末端”（cohesive end）：是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈

4、延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過(guò)互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化。粘性末端有兩種： 如EcoR I切割后形成： 其單鏈末端向5端延伸，稱“5端延伸的粘性末端”。 假定限制位點(diǎn)沿著DNA分子的分布是隨機(jī)的，則平均每44（即256）個(gè)核苷酸出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制酶（如Sau 3A或Mbo I）的靶序列，而識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制酶（如EcoR I）的靶序列每46（即4096）個(gè)核苷酸出現(xiàn)一次。從遺傳工程的角度考慮，選用識(shí)別序列較長(zhǎng)的限制酶可以得到較長(zhǎng)的DNA片段?！巴衙?”（isoschizomer）：來(lái)源不同，但可識(shí)別同樣的DNA靶序列，產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶，即異源同功酶。 如Sma

5、I和Xma I： 如Mbo I和Sau 3A： “同尾酶 ”（isocaudamer）：來(lái)源不同，識(shí)別的靶序列也不同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如 BamH I G GATCC Bcl I T GATCA Bgl II A GATCT Sau 3A GATC Xho II U GATCY （U：嘌呤，Y：嘧啶） 都形成由GATC四個(gè)核苷酸組成的粘性末端。 限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的靶序列同DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)，原則上任何不同來(lái)源的DNA，經(jīng)過(guò)適當(dāng)限制酶的處理之后，可以通過(guò)其粘性末端或平末端連接起來(lái)。這種特性是重組DNA的重要基礎(chǔ)之一。 條件反應(yīng)類型分析制備體積20100 l0.5

6、5 mlDNA0.110 g10500 g酶15 U/ g15 U/ gTris-HCl (pH 7.5)1050 mmol50 mmolMgCl2510 mmol10 mmol2-巰基乙醇510 mmol510 mmolBSA (牛血清蛋白) 50500 g200500 g甘油 5% (v/v) 5% (v/v)NaCl根據(jù)需要根據(jù)需要時(shí)間1 hr15 hr溫度37 37 3.1.3 限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 3.1.3.1 反應(yīng)的一般條件 3.1.3.2 反應(yīng)的操作步驟 對(duì)0.21.0 g DNA進(jìn)行酶切(1) 用微量移液器將DNA移入一潔凈無(wú)菌的微量離心管中(2) 用重蒸水將離心管中的

7、溶液補(bǔ)充到18 l(3) 加入2 l 10倍的限制酶緩沖液(4) 用一個(gè)新的吸頭吸取12單位限制酶，加入到反應(yīng)液中，用手指輕彈離心管外壁使其混勻。在離心機(jī)上離心幾秒鐘，使管壁上的液體回到管底。(5) 將離心管置于限制酶反應(yīng)所需的溫度中，溫浴12 h (6) 終止反應(yīng)： method 1：向反應(yīng)液中加入終濃度為10 mmol/L 的EDTA（乙二胺四乙酸），螯合反應(yīng)液中的二價(jià)鎂離子。method 2：用0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)飽和的重蒸苯酚處理反應(yīng)液，使酶變性失活。再用氯仿抽提除去苯酚后，用二倍體積的乙醇沉淀DNA。method 3：將反應(yīng)液在65水浴中加熱1015

8、 min，這種方法簡(jiǎn)單易行，但少數(shù)限制酶如BamH I，Bgl I，Hind III，Kpm I，Pst I在熱處理后仍保留部分酶活力。 3.1.3.3 影響酶反應(yīng)的因素 1. 星活性 限制性核酸內(nèi)切酶的第二活性又稱星活性：指的是嚴(yán)格典型的識(shí)別序列特異性的放寬，而導(dǎo)致在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割。常在酶名稱的右上角加一星號(hào)表示。 如 EcoR I* ： 通常靶序列為6個(gè)核苷酸 GAATTC 放寬后為4個(gè)核苷酸識(shí)別序列 AATT 星活性的產(chǎn)生可能為限制酶提供新的序列特異性。造成星活性的因素 ：(1) 酶與DNA的比例、甘油濃度： 當(dāng)酶與DNA的比為50 U/g，甘油濃度高于 7.5%(v/v)時(shí)，或酶

9、與DNA的比為10 U/g，甘油濃度高于20% (v/v) 時(shí)，易產(chǎn)生星活性。 甘油會(huì)使許多酶的識(shí)別特異性下降，在使用保存在甘油中的限制酶時(shí)，酶液的用量不應(yīng)超過(guò)反應(yīng)液總體積的十分之一。一般酶切反應(yīng)體系中甘油含量應(yīng)低于5%（最終濃度）。(2) 有機(jī)溶劑：乙醇、乙二醇、二甲亞砜等能產(chǎn)生星活性。(3) 離子強(qiáng)度：對(duì)需要高鹽濃度（100mmol）的酶反應(yīng)，降低鹽濃度也可導(dǎo)致星活性。(4) pH值：pH從7.5增至8.5，會(huì)增加EcoR I 的星活性。(5) 二價(jià)陽(yáng)離子：用Mn2+代替Mg2+，會(huì)激發(fā)EcoR I 和Hind III產(chǎn)生星活性。 為了防止星活性的出現(xiàn)，所有限制性內(nèi)切酶反應(yīng)均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下

10、進(jìn)行（pH、離子強(qiáng)度、二價(jià)陽(yáng)離子）。過(guò)高的甘油濃度、酶/DNA比例以及延長(zhǎng)保溫時(shí)間都應(yīng)避免。 2. DNA的純度 限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA底物的反應(yīng)效率，在很大程度上取決于所使用的DNA本身的純度。 應(yīng)用微量堿法制備的DNA 制劑，常常含有：蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS（十二烷基硫酸鈉），以及高濃度的鹽離子等，這些污染物有可能抑制限制酶的活性。 為了提高限制酶對(duì)低純度DNA制劑的反應(yīng)效率，一般可采用以下方法： (1)增加酶的用量，必要時(shí)每微克DNA的酶用量可高達(dá)10個(gè)單位。 (2)擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋。 (3)延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。 5. DNA的分子結(jié)構(gòu) DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)限制酶的活性有很大的影響。有些限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA時(shí)的酶量，要比消化線性DNA的酶量高出許多倍。還有一些限制酶，切割處于不同部位的限制位點(diǎn)時(shí)，其效率有明顯的差別。這可能是由于DNA序列的核苷酸成分的差異所造成的。 6. 緩沖液 緩沖液有低鹽、中鹽、高鹽三類，不同的內(nèi)切酶，對(duì)鹽濃度要求不一樣。 Buffer(mmol)NaCl(mmol)MgCl2(mmol)Tris-HCl (pH 7.5)(mmol)DTT(mmol)BSA(g