1、生物大分子的分離純化LOGO背景生物分子生物分子（biomolecle）：泛指生物體特有的各種分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。 小分子（如脂類 激素 維生素等）包括 大分子（蛋白質(zhì) 核酸 糖復(fù)合物等）生物大分子是作為生物體內(nèi)主要活性成分的各種分子量達(dá)到上萬或更多的有機(jī)分子 背景在自然科學(xué)，尤其是生命科學(xué)高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究成為探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，沒有達(dá)到足夠純度的生物大分子，結(jié)構(gòu)與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難的工

2、作。 背景 與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)： 生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。 許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。 從動(dòng)物肝組織中分離 提取 純化 鑒定一種酶從生物樣品中分離提純生物大分子一般常用的技術(shù)路線和設(shè)計(jì)方案。選擇材料和預(yù)處理細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離提取和純化濃縮

3、干燥 保存對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)先將新鮮的肝臟冷凍23h，提出脂肪和結(jié)締組織，切成小塊以備后用。細(xì)胞的破碎機(jī)械破碎高速組織搗碎 玻璃勻漿器勻漿物理破碎超聲波處理法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎取肝臟樣品，加入提取液，

4、依據(jù)所提取酶的不同，還可加入不同的試劑，以起到保護(hù)蛋白質(zhì)或增加蛋白質(zhì)可溶度的作用。常用的試劑有：酚類結(jié)合劑PVPP，金屬螯合劑 Na2EDTA，以及SH化合物以保護(hù)蛋白質(zhì)，或加入非離子型去垢劑如Triton X100，以增加蛋白質(zhì)的可溶度，可用于與膜脂結(jié)合的酶。提取和純化通常在做純化前對自己的目標(biāo)物質(zhì)特性了解越多對純化將會(huì)越有利，如果不太了解，也可以通過電泳知道目標(biāo)物質(zhì)和雜質(zhì)的情況 ，找到一種簡單的鑒定方法，此外在純化前必須先建立可靠的活性測定的方法。 如果是未知的蛋白，那么通?？梢杂袔追N簡單的摸索： 1.凝膠過濾色譜 這個(gè)方法很常用，但是效率不高，對低濃度的樣品沒有富集作用，上樣量小。 2.

5、離子交換色譜 此法也很常用，但是樣品必須沒有高濃度的鹽。 3.疏水色譜 此法較好，它分離效率高，上樣量大，特別適合分離鹽析沉淀的樣品。 4.親和色譜 是最有效的手段，關(guān)鍵了解目標(biāo)物質(zhì)的特性以便 選擇合適的親和色譜填料。 如果知道蛋白質(zhì)的特性，則可以依據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)對其進(jìn)行分離，常用的方法有： 等電點(diǎn)沉淀法 ：蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。低溫有機(jī)溶劑沉淀法 ：用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高

6、，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低 超濾原理的示意圖 凝膠過濾法 ：也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（agarose gel） 依據(jù)蛋白質(zhì)帶點(diǎn)性質(zhì)不同電泳法：種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。 離子交換層析法 ：離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE等，）當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。 濃縮 干燥 保存一 樣品的濃縮 ： 1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮 2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮 3、冰凍法 4、吸收法 5、超濾法 二、干燥：常用的方法是冷凍干燥和真空干燥三、貯