1、PAGE 11 -強(qiáng)化乳酸菌釀造高酸黃酒工藝研究低度黃酒的酒精度一般為8.0%vol12.5%vol，適合年輕一代消費(fèi)者的口味喜好1，近年來得到迅速發(fā)展。目前低度黃酒生產(chǎn)工藝主要有原酒稀釋法和醪液稀釋發(fā)酵法2種2-3，由于醪液稀釋發(fā)酵法釀造的低度黃酒在壇中貯存容易污染微生物導(dǎo)致酸敗變質(zhì)1,4，因此目前大多數(shù)廠家采用原酒稀釋法生產(chǎn)低度黃酒，即先釀成酒精度較高的黃酒，然后加水稀釋。但加水稀釋后總酸較低，而酸類物質(zhì)是黃酒的重要口味物質(zhì)，總酸低的黃酒口感淡薄5。為解決該問題，在實(shí)際生產(chǎn)中通常采用添加貯存或發(fā)酵過程中酸敗黃酒樣來提高總酸。但有的酸敗黃酒有異氣異味，且酸敗黃酒的生物胺含量遠(yuǎn)高于正常釀造的黃

2、酒6。生物胺具有一定的生理副作用，是引起黃酒飲后不適癥狀的主要成分之一7-8。乳酸菌(lacticacidbacteria)是參與黃酒發(fā)酵的重要微生物之一，浸米和發(fā)酵過程都離不開乳酸菌9-10。乳酸菌產(chǎn)酸可以為黃酒醪液提供酸性發(fā)酵環(huán)境，抑制其他雜菌生長。在黃酒釀造中，通過接種乳酸菌浸米能消除浸米環(huán)節(jié)的異嗅味，改善浸米品質(zhì)，大幅降低米漿水中生物胺含量11-12。此外，生物強(qiáng)化技術(shù)被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的釀造中，ZHANG等13通過強(qiáng)化曼舒里畢赤酵母(Pichiamanshurica)發(fā)酵山西老陳醋大曲，提高了醋中總酸和總酯含量；WANG等14在醋酸發(fā)酵開始時接種巴斯德醋酸桿菌(Acetobac

3、terpasteurianus)，增加了鎮(zhèn)江香醋的風(fēng)味，縮短了醋酸發(fā)酵周期，同時提高了總酸和2,3-丁二醇的含量；王曉勇15通過接種酵母菌和醋酸菌強(qiáng)化大曲生產(chǎn)汾酒醋酸調(diào)味酒，使汾酒的香氣成分更加豐富，風(fēng)味更加協(xié)調(diào)。為改善低度黃酒生產(chǎn)中由酸敗黃酒調(diào)酸引起的異氣異味和生物胺問題，提高低度黃酒品質(zhì)和安全水平，本研究采用前期篩選的1株低產(chǎn)生物胺、高產(chǎn)乳酸的乳酸菌進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，以期釀造出酸度高且能較好地保持黃酒風(fēng)味的調(diào)酸用高酸黃酒。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CGMCCNo.12757，從黃酒發(fā)酵醪液中篩選得到，該菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)

4、且低產(chǎn)生物胺；工業(yè)黃酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N85，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2實(shí)驗(yàn)材料糯米、麥曲，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。1.2儀器與設(shè)備Agilent1260高效液相色譜，美國Agilent公司；QP2022UltraGS/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司；PHS-3EpH計(jì)，瑞士MettlerToledo公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1酵母和乳酸菌培養(yǎng)米汁的制備：糯米浸泡2d，蒸飯，按100g糯米飯質(zhì)量加入300mL水、5g熟麥曲和10000U糖化酶，于5560下糖化5h，稠袋過濾，調(diào)整糖度為12Bx，分裝后于115滅菌20min。培養(yǎng)方法：將

5、酵母和乳酸菌種子液分別接種于米汁中，接種量為10%，酵母于30下振蕩培養(yǎng)12h，乳酸菌于37下靜止培養(yǎng)12h。1.3.2黃酒釀造實(shí)驗(yàn)配方m(糯米)m(水)=11.7、酵母培養(yǎng)液5%、乳酸菌培養(yǎng)液2%、麥曲用量17%；工藝參數(shù)：浸米時間2d，前發(fā)酵(主酵)在30下發(fā)酵4d，后發(fā)酵在15下發(fā)酵15d。黃酒釀造工藝流程如下：1.3.3高酸黃酒釀造單因素試驗(yàn)1.3.3.1乳酸菌接入時間對黃酒總酸的影響其他因素不變，乳酸菌接種時間分別設(shè)定為0、1、2、3、4d進(jìn)行黃酒釀造實(shí)驗(yàn)，并以不接乳酸菌的黃酒發(fā)酵作為空白對照。1.3.3.2麥曲添加量對黃酒總酸的影響其他因素不變，麥曲添加量分別設(shè)定為10%、14%、

6、17%、20%、23%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行黃酒釀酒實(shí)驗(yàn)。1.3.4均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化高酸黃酒釀造工藝以釀制黃酒的總酸和酒精度為指標(biāo)，選取乳酸菌接種量、料水比和主酵溫度作為實(shí)驗(yàn)因素，按照DPS9.5軟件設(shè)計(jì)3因素8水平均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3.5黃酒常規(guī)理化指標(biāo)的測定發(fā)酵液中酒精度、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮含量的測定方法參考GB/T136622022黃酒。1.3.6黃酒中有機(jī)酸含量的測定前處理：取10mL樣品于100mL容量瓶中，加入2mL30%硫酸鋅溶液和2mL15%亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，用超純水定容，靜置30min，用濾紙過濾，再經(jīng)0.22m膜過濾后用于HPLC分析。色譜條件：參考文獻(xiàn)16并稍作改動，

7、色譜柱為WatersAtlantisT3dC18(4.6mm250mm，5m)，柱溫35，流動相20mmol/LNaH2PO4(用磷酸調(diào)pH至2.7)，進(jìn)樣量20L，流速1mL/min，檢測波長210nm。1.3.7黃酒中生物胺含量的測定采用HPLC法測定黃酒中生物胺含量17。1.3.8黃酒游離氨基酸含量的測定采用HPLC法測定黃酒中16種游離氨基酸含量18。1.3.9黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測定19-20頂空固相微萃取條件：黃酒樣品先經(jīng)3000r/min離心20min，取2mL上清液，加入4mL純凈水，2.5g氯化鈉，10L內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇，89.65mg/L)，萃取溫度50，預(yù)熱15min

8、，萃取時間40min，GC解吸5min(250)。GC-MS條件：色譜柱型號DB-Wax毛細(xì)管柱(30m0.25mm0.25m)，柱初始溫度40保持5min，以5/min上升至150，再以10/min上升至230，然后保持10min。載氣為高純度氦氣，流速1.0mL/min，進(jìn)樣口溫度為250，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣。MS接口溫度為230，電子轟擊離子源，掃描范圍(m/z)為30550amu，電子能量為70eV，離子源溫度為210。以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量。1.3.10數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS25進(jìn)行，每個試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行單因素方差分析(P0.05)。2結(jié)果

9、與分析2.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化黃酒釀造工藝2.1.1乳酸菌接種時間對黃酒發(fā)酵的影響不同乳酸菌接種時間釀制黃酒的酒精度和總酸含量檢測結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵1、2、3、4d接入乳酸菌與未接入乳酸菌(對照)相比，黃酒的酒精度具有顯著差異，總酸略有提高，但差異不顯著。而在投料時(0d)接種乳酸菌能顯著提高總酸含量，發(fā)酵結(jié)束時總酸達(dá)到11.9g/L、酒精度為13.2%vol，與對照黃酒相比，總酸提高了190%、酒精度下降17.5%。在發(fā)酵1d后接入乳酸菌，由于醪液中已有較高含量的酒精21，可能對乳酸菌的生長產(chǎn)生抑制，因而無法達(dá)到增酸效果。因此，選擇在投料時接種乳酸菌為最佳接種時間。圖1乳酸菌接種時間對黃酒酒

10、精度和總酸含量的影響Fig.1EffectofinoculationtimeoflacticacidbacteriaonthecontentsofalcoholandtotalacidinHuangjiu2.1.2麥曲添加量對黃酒發(fā)酵的影響麥曲在黃酒釀造過程中具有極其重要的作用，傳統(tǒng)黃酒釀造中麥曲的用量約為原料米的1/622-23。麥曲添加量對黃酒發(fā)酵的影響如圖2所示，麥曲添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))從10%增加到17%時，黃酒的酒精度和總酸含量逐漸增加，而麥曲添加量從17%增加到23%時，黃酒的酒精度和總酸含量略有上升。較高的麥曲添加量會增加生產(chǎn)成本，而黃酒廠進(jìn)行常規(guī)黃酒釀造時，麥曲添加量一般為17%

11、左右，故選擇麥曲添加量為17%。圖2麥曲添加量對黃酒酒精度和總酸含量的影響Fig.2EffectofdosageofwheatQuonthecontentsofalcoholandtotalacidinHuangjiu2.2均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝以乳酸菌接種量(X1)、料水比(X2)和主酵溫度(X3)為優(yōu)化因素，利用DPS的優(yōu)化系統(tǒng)建立3因素8水平的均勻設(shè)計(jì)，所得設(shè)計(jì)方案的中心偏差較高(CD=0.1024)，為此將實(shí)驗(yàn)次數(shù)由8次提高到16次，以降低試驗(yàn)的中心偏差(CD=0.0784)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表1所示。以所釀黃酒的總酸含量為評價指標(biāo)，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸分析方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得回

12、歸方程Y=6.4122+0.4371X1+14.9968X2-0.4006X3-0.0532X12-0.8023X22+0.0120X32-0.0168X1X2-0.3242X2X3+0.0069X1X3，相關(guān)系數(shù)R=0.9719，F(xiàn)值=11.41，顯著水平P=0.0039。由回歸方程得到最優(yōu)工藝參數(shù)為乳酸菌接種量5.3%、料水比12.5(gmL)、前酵溫度24，總酸最高值為18.2g/L。對得到的最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證：即以乳酸菌投料時加入、麥曲用量17%、乳酸菌接種量5.3%、料水比12.5(gmL)、前酵溫度24的工藝進(jìn)行黃酒發(fā)酵試驗(yàn)，重復(fù)3次，對檢測結(jié)果取平均值。所釀黃酒的酒精度為12.5%

13、vol、總酸達(dá)17.5g/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測較吻合。高酸黃酒的總酸含量較高可以減少勾兌時的用量，而酒精度12.5%vol既能較好地保持黃酒風(fēng)味，又與低度黃酒的酒精度較為一致，方便勾調(diào)操作。表1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table1Mixed-levelsuniformexperimentaldesignandresult2.3高酸黃酒的理化指標(biāo)、微理組分及風(fēng)味組分分析2.3.1常規(guī)理化指標(biāo)高酸黃酒和對照黃酒的理化指標(biāo)見表2。與對照組黃酒相比，高酸黃酒的酒精度和氨基酸態(tài)氮含量分別降低了21.8%和27.9%，而總酸含量提高了326.8%。表2高酸黃酒和對照黃酒的理化指標(biāo)Table2Detection

14、ofphysiochemicalindexesinhigh-acidityHuangjiuandcontrolHuangjiu2.3.2黃酒中主要有機(jī)酸含量乳酸是黃酒中含量最高的有機(jī)酸，能給黃酒帶來醇厚感；乙酸是黃酒中的主要揮發(fā)性酸，其含量過高時會使黃酒產(chǎn)生不愉悅甚至酸敗氣味，而酸敗黃酒往往乙酸含量很高24。高酸黃酒和對照黃酒中主要有機(jī)酸含量見表3，與對照黃酒相比，高酸黃酒中乳酸和乙酸含量分別提高了397.2%和79.3%，乳酸與乙酸質(zhì)量比由1.71提高至4.61。因此，高酸黃酒用于低度黃酒生產(chǎn)中的調(diào)酸有利于改善產(chǎn)品風(fēng)味。表3高酸黃酒和對照黃酒中有機(jī)酸含量的檢測Table3Detectiono

15、fthecontentorganicacidsinhigh-acidityHuangjiuandcontrolHuangjiu2.3.3黃酒中生物胺含量高酸黃酒和對照黃酒中生物胺含量見表4。與對照黃酒相比，高酸黃酒中3種生物胺總量下降34.3%，用于低度黃酒調(diào)酸可提高產(chǎn)品的安全性。生物胺主要通過微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸產(chǎn)生的，一方面本研究所用乳酸菌為篩選的低產(chǎn)生物胺植物乳桿菌，另一方面在發(fā)酵初期接種乳酸菌，降低了黃酒發(fā)酵體系中的pH，抑制了雜菌的生長，使所釀黃酒中生物胺含量低于常規(guī)黃酒25-26。表4高酸黃酒和對照黃酒的生物胺含量單位：mg/LTable4Contentsofb

16、iogenicaminesinhigh-acidityHuangjiuandcontrolHuangjiu2.3.4黃酒中游離氨基酸含量高酸黃酒和對照黃酒中游離氨基酸含量見表5。與對照黃酒相比，高酸黃酒中16種游離氨基酸含量下降43.4%。其原因可能是：一方面低pH抑制了麥曲中蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解不完全；另一方面乳酸菌生長繁殖需要消耗氨基酸作為氮源。2.3.5黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量高級醇是酒類重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，但含量過高時易產(chǎn)生雜味和致醉27-28。與對照黃酒相比，高酸黃酒中高級醇總量下降35.3%(表6)，其中黃酒的主要高級醇異戊醇和異丁醇分別降低了50.3%和58.9%。一方

17、面可能由于強(qiáng)化乳酸菌使醪液中總酸含量提高，從而抑制了酵母代謝形成高級醇；另一方面可能由于采用較低的主酵溫度(24)所致21。酯類是黃酒最重要的香氣化合物，高酸黃酒中總酯含量較對照黃酒有所提高，可能由于高含量的有機(jī)酸促進(jìn)了酯化反應(yīng)。表5高酸黃酒和對照黃酒中游離氨基酸含量單位：mg/LTable5Contentsoffreeaminoacidsinhigh-acidityHuangjiuandcontrolHuangjiu表6高酸黃酒和對照黃酒中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量單位：mg/LTable6Contentsofvolatileflavorcompoundsinhigh-acidityHuangjiuandcontrolHuangjiu3結(jié)論通過單因素試驗(yàn)和均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，得到強(qiáng)化乳酸菌釀