1、大孔吸附樹脂別離純化草珊瑚總黃酮的工藝研究【摘要】目的研究大孔吸附樹脂別離純化草珊瑚總黃酮工藝，為草珊瑚總黃酮的工業(yè)化消費(fèi)提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法以貴州產(chǎn)草珊瑚為原料，以草珊瑚總黃酮含量及回收率等為考察指標(biāo)，選用大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮進(jìn)展別離純化，分別采用靜態(tài)試驗(yàn)、動(dòng)態(tài)試驗(yàn)等考察大孔樹脂對草珊瑚總黃酮的別離純化效果及影響因素。結(jié)果AB-8型大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮靜態(tài)飽和吸附量為116.25gg-1干樹脂，洗脫率92.9%，動(dòng)態(tài)飽和吸附量為94.5gg-1干樹脂，總黃酮回收率在96.1%、純度在90%以上，是實(shí)驗(yàn)樹脂中別離純化草珊瑚總黃酮的最正確大孔吸附樹脂。結(jié)論別離純化草珊瑚總黃酮最正確工藝

2、條件為：AB-8型大孔吸附樹脂，洗脫劑為70%乙醇，洗脫劑用量為3倍樹脂體積，流速34l/in，上柱總黃酮量與樹脂比為110.5，上柱液總黃酮濃度為19.8g/l，流速23l/in，沖洗雜質(zhì)用水體積23BV，上柱液pH值45?！娟P(guān)鍵詞】大孔樹脂草珊瑚總黃酮?jiǎng)e離純化Abstrat:bjetiveAethdfrseparatinandpurifiatinftheflavnidsfrSarandraeglabraitharprusresinasstudied.ethdsByusingSarandraeglabrainGuizhuandiththententandreveryratefflavnids

3、asindexesandthestatiabsrptinapaityandthestatielutinratierebserved.ResultsTheresultsereasfllls:ThestatiabsrptinapaityfAB-8typeresinas116.25gg-1,thestatielutinratias92.9%,thedynaiabsrptinapaityfAB-8typeresinas94.5gg-1,thereveryrateasrethan96.1%andthepurityasrethan90%.AB-8typeresinasthebestfrseparating

4、andpurifiatingSarandraeglabrainflavnids.nlusinTheptiunditinsis:AB-8typearprusresin,theeluantis70%alhland3tiesasthevlueftheresin,thevlueftheresinis10.5tiesfflavnidsinsaple,nentratinfflavnidsfsapleis19.8gl-1andurrentvelityf23lin-1,pHvaluefsapleis45.Keyrds:arprusresin；Sarandraeglabra；Flavnids；Separatin

5、；Purifiatin草珊瑚Sarandraglabra(Thunb.)Nakai為多年生常綠草本或亞灌木，系金粟蘭科草珊瑚屬植物，藥用全草。在我國長江以南各省均有分布，特別是云、貴、川較為多見。草珊瑚葉苦辛、性溫、有小毒，有祛風(fēng)通絡(luò)、活血祛淤、止血止痛、接骨續(xù)筋之成效，民間常用來治療風(fēng)濕痹癥，跌打損傷等1及作茶飲用，已有數(shù)百年的歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)，藥理、毒理研究說明草珊瑚具有抗菌消炎，抑制多種病原菌，清熱解毒，抗多種腫瘤，促進(jìn)骨折愈合，改善血液循環(huán)，鎮(zhèn)痛，抗疲勞，抗氧化，抑制流感病毒等多種生物活性2。毒性實(shí)驗(yàn)說明草珊瑚及其提取物無毒；動(dòng)物精子畸性實(shí)驗(yàn)，小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)等均為陰性，未發(fā)現(xiàn)致突變

6、作用，所以是非常平安的3，4。目前，草珊瑚的加工產(chǎn)品有醫(yī)藥、獸藥品，保健品，食用品等數(shù)十種之多。黃酮類化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的藥用有效成分之一2。隨著草珊瑚在醫(yī)藥、獸藥、保健食品及保健用品領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛，而對草珊瑚總黃酮的別離純化研究尚未見到系統(tǒng)報(bào)道。為了更合理地開發(fā)利用草珊瑚資源，本研究以草珊瑚總黃酮含量及回收率等為考察指標(biāo)，選用大孔吸附樹脂別離純化草珊瑚總黃酮，分別采用靜態(tài)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)等考察大孔樹脂對草珊瑚總黃酮的別離純化效果及影響因素，研究別離純化草珊瑚總黃酮的最正確工藝條件及各種影響因素。從而為消費(fèi)中最有效的開發(fā)利用草珊瑚、發(fā)揮草珊瑚的最大經(jīng)濟(jì)效益提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材

7、料與儀器草珊瑚全草均采自貴州省江口縣同一地點(diǎn)，由本院生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)展鑒定及采用統(tǒng)一的枯燥方法加工制樣，防止背景干擾。所用試劑NaN2，Al(N3)3，NaHS3，NaS3，EDTA，吐溫-80等均為分析純，乙醇為95%食用酒精，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為美國Siga公司產(chǎn)品、含量大于98%；大孔吸附樹脂：D3520型，AB-8型，NKA-9型，D4020型，S-8型南開大學(xué)化工廠。TU-1800紫外可見分光光度計(jì)北京普析，RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮，不銹鋼提取鍋武漢立中，PHSJ3F精細(xì)酸度計(jì)上海雷磁，ALG5/10自動(dòng)灌裝封口機(jī)上海國彩，電子天平美國奧豪斯，恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠)；鼓風(fēng)枯燥箱(

8、上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；植株樣本粉碎機(jī)(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；液體自動(dòng)混合機(jī)北京長安儀器廠。2方法與結(jié)果2.1草珊瑚總黃酮的測定方法草珊瑚總黃酮的測定方法采用蘆丁比色法5，測定波長500n，回歸方程：=84.317A-0.77361，(r=0.9998)，吸光度線性范圍：0.10.6，加樣回收的平均回收率99.37%，RSD=1.85%n=6；精細(xì)度測定RSD=0.95%。2.2草珊瑚總黃酮純化用樣品液的制備取草珊瑚全草除根干品粗粉500g，根據(jù)作者已有試驗(yàn)L934正交設(shè)計(jì)挑選出的草珊瑚總黃酮乙醇浸提最優(yōu)程度組合工藝：即采用60%乙醇、80溫度，3h/次，提取3次進(jìn)展提取制備，制得草珊瑚總黃酮提取液總黃

9、酮含量：9.5gl-1冷藏備用。2.3大孔吸附樹脂的挑選68將D3520型、AB-8型、NKA-9型、D4020型、S-8型樹脂先用4倍體積量95%乙醇或丙酮浸洗均可，至浸洗液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時(shí)止，用水反復(fù)清洗干凈至無醇味或無酮味，參加4倍體積量2lL-1的氫氧化鈉溶液，浸泡12h，以水洗至中性；再參加4倍體積量4lL-1的鹽酸，浸泡12h，用蒸餾水洗至中性后60烘干備用。精細(xì)稱取經(jīng)上述預(yù)處理的干樹脂1g共3份，置100l三角瓶中，精細(xì)參加2.2項(xiàng)下制取的樣品液20l后震蕩吸附，頻率120次/in，1分鐘間隔振蕩2h，然后靜置20h，使其到達(dá)飽和吸附，汲取上層液測定總黃酮濃度，按下式

10、計(jì)算樹脂飽和吸附量：飽和吸附量=初始濃度-吸附后濃度吸附液體積/樹脂量gg-1干樹脂，取三次平均值。將經(jīng)靜態(tài)飽和吸附總黃酮后樹脂濾出，吸干外表水分，精細(xì)參加60%濃度的乙醇20l后同上法震蕩2h后濾出，測定洗脫液總黃酮的濃度，計(jì)算洗脫率：洗脫率=洗脫液濃度洗脫液體積/飽和吸附量100%，取3次平均值。結(jié)果見表1。表15種樹脂對草珊瑚總黃酮的靜態(tài)飽和吸附洗脫結(jié)果略上述結(jié)果說明5種大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮的靜態(tài)飽和吸附量均在90g以上，以AB-8型樹脂靜態(tài)吸附量最大；在靜態(tài)洗脫中，AB-8型樹脂洗脫率為92.9%，高于其它4種，AB-8型樹脂表現(xiàn)出最正確的綜合性能。2.4洗脫劑濃度的挑選精細(xì)稱取

11、預(yù)處理好的AB-8型干樹脂1g共7份，分別置100l三角瓶中，精細(xì)參加2.2項(xiàng)下制取的樣品液20l后按2.3項(xiàng)下同法震蕩，使其到達(dá)飽和吸附，別離樹脂，吸干外表水分。對應(yīng)參加濃度分別為30%，40%，60%，70%，70%，80%，90%的乙醇各20l后同法震蕩洗脫2h后過濾出，測定洗脫液總黃酮濃度，計(jì)算洗脫率算法見2.3項(xiàng)下。結(jié)果見表2及圖1。表2乙醇濃度對AB-8型樹脂洗脫率的影響略表2說明,洗脫劑乙醇濃度增高，洗脫率逐漸增大，70%90%的乙醇洗脫率均在90%以上，而乙醇濃度高易揮發(fā)，從經(jīng)濟(jì)、平安、節(jié)約出發(fā)本實(shí)驗(yàn)選用70%乙醇為洗脫劑。2.5pH對AB-8型樹脂吸附量的影響精細(xì)稱取已預(yù)處理

12、好的干樹脂1g共8份，各置100l三角瓶中，精細(xì)參加pH3，4，5，6，7，8，9，10樣品液各20l按2.3項(xiàng)下同法震蕩，使其到達(dá)飽和吸附，汲取上層液測定總黃酮濃度，按2.3項(xiàng)下公式計(jì)算樹脂飽和吸附量。結(jié)果見表3及圖2。表3pH對AB-8型樹脂飽和吸附量的影響略表3說明，上樣液以pH4飽和吸附量最大。2.6AB-8型樹脂對草珊瑚總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附-洗脫量測定稱取已處理好的AB-8型吸附樹脂100g和20g，分別濕法裝入3500的色譜柱中，將2.2項(xiàng)下制取的草珊瑚提取液330l9.5gl-1以23lin-1的流速上柱，過柱完后用3倍樹脂體積量3BV，下同的蒸餾水以34lin-1的速度洗柱至洗脫液

13、無色，再用4BV70%的乙醇以23lin-1的洗脫速度洗脫至無色透明，搜集70%的乙醇洗脫液，按2.1項(xiàng)下方法測定總黃酮含量，計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附洗脫量，總黃酮回收率等回收率過柱后總黃酮質(zhì)量/過柱前總黃酮質(zhì)量100%。結(jié)果見表4。表4AB-8型大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附-洗脫結(jié)果略表4說明，裝柱量為100g的色譜柱總黃酮回收率為96.13%，說明已吸附完全，而每克樹脂吸附量為30.3g，未達(dá)飽和。裝柱量為20g的色譜柱總黃酮回收率為60.97%，說明未吸附完全，而每克樹脂吸附量為94.5g，吸附量已達(dá)飽和。其吸附量94.5gg-1干樹脂即為AB-8型大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮的飽和動(dòng)態(tài)吸附-

14、洗脫量。2.7樹脂用量對吸附草珊瑚總黃酮的影響精細(xì)稱取預(yù)處理好的AB-8型干樹脂1g共4份，分別置100l三角瓶中，按樣品液體積與樹脂質(zhì)量比(l:g)51，101，151，201的比例分別精細(xì)參加2.2項(xiàng)下制取的樣品液后按2.3項(xiàng)下同法震蕩，使其到達(dá)飽和吸附，汲取上層液測定總黃酮濃度，計(jì)算吸附率吸附率吸附總黃酮質(zhì)量/吸附前總黃酮質(zhì)量100%。別離樹脂，吸干外表水分，對應(yīng)參加60%的乙醇各20l后同法震蕩洗脫2h后過濾出，測定洗脫液總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮回收率算法見2.6項(xiàng)下。結(jié)果見表5。表5AB-8型大孔吸附樹脂用量對吸附草珊瑚總黃酮的影響略表5說明上樣液與樹脂比為51101時(shí)吸附率、回收率最

15、高。而51時(shí)大孔樹脂利用不完全有浪費(fèi)，以101總黃酮質(zhì)量樹脂質(zhì)量=110.5時(shí)為最正確用量。2.8樣品上柱液濃度對回收率的影響分別稱取已處理好的AB-8型吸附樹脂450g共3份，濕法裝入5500的色譜柱中，取草珊瑚浸膏3份，130g/份含總黃酮27.8g，分別按2BV1400l，3BV2100l，4BV2800l加水溶解過濾后上柱，流速23lin-1，分別搜集過柱液，測其中總黃酮?dú)埩袅坎⒂?jì)算總黃酮回收率。結(jié)果見表6。表6說明，上柱液中總黃酮含量一樣,而濃度，體積不同2BV，3BV，4BV時(shí)，對草珊瑚總黃酮吸附量、回收率有影響。4BV上柱液過柱后殘液中總黃酮含量最多，損失量未被吸附量占總黃酮總量

16、的6.97%；而2BV體積上柱液損失量最小為1.6%，總黃酮回收率最高。由此可見，進(jìn)步上柱液濃度有利于吸附和節(jié)省時(shí)間。表6上柱液濃度對AB-8型大孔吸附樹脂吸附草珊瑚總黃酮的影響略2.9沖洗雜質(zhì)用水體積對回收率的影響按2.8試驗(yàn)條件下草珊瑚樣品液4份，分別按2BV1400l加水溶解過濾后上柱，流速23lin-1，過柱完后一份不用水沖洗洗脫，另3份分別用1BV水700l，2BV水，3BV水沖洗后洗脫，分別測定每份過柱水及洗脫劑中總黃酮含量并計(jì)算損失量及水沖洗對總黃酮純度及回收率影響。結(jié)果見表7。表7沖洗雜質(zhì)用水體積對AB-8型大孔樹脂吸附草珊瑚總黃酮的影響略表7說明，吸附后用水沖洗對已吸附的總黃

17、酮會(huì)有一定量的損失，水洗體積越大,損失量越多，總黃酮回收率降低，但水洗可除去雜質(zhì)，進(jìn)步總黃酮純度。綜合各因素,沖洗雜質(zhì)用水體積以23BV為宜。2.10洗脫劑洗脫次數(shù)確實(shí)定按2.8實(shí)驗(yàn)條件下草珊瑚樣品1份，按2BV1400l加水溶解過濾后上柱，流速23lin-1，過柱完后用70%乙醇作洗脫劑，按1BV700l洗脫，共洗脫5次，搜集每次洗脫劑，測定其中總黃酮含量并計(jì)算總黃酮回收率。結(jié)果見表8及圖3。表8洗脫劑洗脫次數(shù)對AB-8型樹脂吸附草珊瑚總黃酮回收率影響略從表8可看出，總黃酮洗脫量主要集中在第1，2，3次，占總黃酮回收率的96.12%。洗脫劑用量為3倍樹脂體積比擬適宜。3結(jié)果與討論3.1實(shí)驗(yàn)說

18、明，5種大孔吸附樹脂以AB-8型大孔吸附樹脂對草珊瑚總黃酮有較大靜態(tài)吸附量,為116.25g.g-1，洗脫率為92.9%，高于其它四種大孔吸附樹脂。同時(shí)，其動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能也最好，總黃酮回收率為96.13%。綜合考慮各因素,AB-8型大孔吸附樹脂為別離純化草珊瑚總黃酮的最正確樹脂。3.2分別對影響AB-B型樹脂吸附、洗脫的因素進(jìn)展了考察，研究說明：洗脫劑乙醇濃度增高，洗脫率逐漸增大，7090%的乙醇洗脫率均在90%以上，而乙醇濃度高易揮發(fā)，從經(jīng)濟(jì)，節(jié)約出發(fā)選用70%乙醇即可。上樣液pH以45時(shí)飽和吸附量最大。因黃酮類化合物多具酚羥基，顯弱酸性，當(dāng)上樣液pH偏大時(shí)，草珊瑚總黃酮有離子化趨勢而不易被吸附。因此，上樣液pH偏酸有利于吸附。3.3目前，尚未見有大孔吸附樹脂別離純化草珊瑚總黃酮上樣濃度的報(bào)導(dǎo)，但有報(bào)導(dǎo)上樣液濃度對吸附量有影響8。本研究說明上樣液濃度與吸附量呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，19.82gL-1吸附量明顯高于9.93gL-1，適當(dāng)進(jìn)步上樣液濃度有利于吸附。上樣液濃度以別離的目的產(chǎn)物草珊瑚總黃酮計(jì)，可消除草珊瑚藥材產(chǎn)地、品種等不同造成的總黃酮含量的差異，有利于保證吸附及減少損失