1、iPS細(xì)胞定向分化為胰島（3細(xì)胞研究小組成員：劉楠，李輝瑩，吳德偉，竇坤，蔣韜，周激，陳培，曾揚(yáng)，楊楊，李磊，吳 尚宜，朱翔龍指導(dǎo)教師：高紹榮博士Abstract:B cellsiPS cells are somatic cell derived pluripotent cells induced by four factors. These cells can give rise to derivatives of all three germ layers. iPS cells have the potential to be differentiated into cell types

2、such as neurons and blood precursors, which has broad implications for the use of stem cells for potential use in therapy. In this project we want to induce iPS cells instead of ES cells to induce pancreatic 3 delisransplantation therapy of type I diabetes mellitus which is caused by an autoimmune d

3、estruction of the insulin- producing 3 cells.A. Introduction to iPS cells and PancreaticWhat are iPS cells?iPS 細(xì)胞（induced pluripotent stem cells ）這一名詞由 Yamanaka 在 2006 年提出。他的小 組通過對(duì)胚胎干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞中存在一系列特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，而當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，這些蛋白表達(dá)減少。那么如果在小鼠體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)這些蛋白，能否使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈杉?xì)胞全能性質(zhì)的細(xì)胞呢？經(jīng)過對(duì)這些因子的組合和篩選，他們確定了Oct4,Sox

4、2, c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子。他們使用慢病毒載體將這四種因子（及其各自的啟 動(dòng)子）導(dǎo)入到小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中，并經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)了具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞群落。這 些細(xì)胞群落具有胚胎干細(xì)胞特異的表面抗原（Stage specific embryonic antigen , SSEA）,也通過 Teratoma formation Chimera formation 和 Tetraploid complementation 檢測(cè)（參考 method）,814Sqk2KH4 cN/lycorOGt4 &k2 Naitog Jri20iPSFibroblasiGurTWt Opinion in

5、 Ger dies & Dsvalopmsrit充分證明了它們具有多能性( pluripotent),因此命名為induced Pluripotent Stem cells。12007年12月，日本的 Yamanaka和美國(guó)威斯康辛大學(xué)的Thomson小組分別在 cell和science上同時(shí)發(fā)表自己的研究成果1,2,他們成功地將人的成纖維細(xì)胞重編程，誘導(dǎo)成為了多能干細(xì)胞。與小鼠中的方法相同，他們將四種因子轉(zhuǎn)入體細(xì)胞中。兩個(gè)小組導(dǎo)入的因子有兩個(gè)是相同的(Oct4, Sox2), Yamanaka小組的另兩個(gè)因子是c-myc和klf4 ,而Thomson的是nanog和lin28。Oct4, S

6、ox2被證明是維持干細(xì)胞狀態(tài)所必需的因子，而另外兩個(gè)因子 更多起到的是促進(jìn)轉(zhuǎn)化和抑制凋亡的作用。這兩套因子具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。事實(shí)上除了Oct4外，其他因子多可被其家族中的同源蛋白取代。3Fig. 1體細(xì)月( Fibroblast)加入四種因子以后，重編程為 iPS細(xì)胞。iPS細(xì)胞具有分化為三個(gè)胚層細(xì) 胞的能力，已經(jīng)證明可以分化為血細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。Taken from Laurie A Boyer, Current Opinion in3 Genetics&DevelopmentWhy iPS?iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì) 胞相比有很多優(yōu)點(diǎn)。一是來源。胚胎干細(xì) 胞(embryonic stem cell

7、s , ESCs)是指當(dāng)受精卵分裂 發(fā)育成囊胚時(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)Fig. 2 Embryonic stem cells are derived from inner cell mass of theBlastocyst. Taken from Pesce and Sch? ler, 1998cell(Inner Cell Mass)的細(xì)胞，如圖2。取得胚胎干細(xì)胞必須破壞胚胎。因此對(duì)人胚胎干細(xì)胞的研究一直阻力重重。而iPS細(xì)胞則由體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，不存在類似的問題。二是用于治療時(shí)，異源的胚胎干細(xì)胞治療會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。iPS細(xì)胞取自病人組織，產(chǎn)生的是病人特異的干細(xì)胞，避免了上述問題。當(dāng)然iPS細(xì)胞現(xiàn)階段

8、也存在缺點(diǎn)。在Yamanaka小組使用的因子中，c-myc是原癌基因，小鼠iPS實(shí)驗(yàn)證明此基因的失控會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。而除此之外，iPS小鼠存在明顯的健康問題，死亡率很高。Yamanaka小組已經(jīng)通過去除 c-myc因子進(jìn)行了研究，在小鼠和人實(shí)驗(yàn)中得到了很好的結(jié)果。4另外，慢病毒載體的使用也會(huì)導(dǎo)致基因組的整合，誘發(fā)危險(xiǎn)?？傊琲PS在研究和應(yīng)用上都面臨著很多的挑戰(zhàn)，解決這些問題將促進(jìn)iPS細(xì)胞在臨床治療中的研究及應(yīng)用。Differentiation of iPS cells to pancreatic3 cells已經(jīng)有研究將iPS用于治療鐮刀型貧血癥的研究，并在小鼠體內(nèi)取得了成功5。我們小組

9、著眼于iPS細(xì)胞向胰島3細(xì)胞的分化。通過利用體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPS細(xì)胞，然后將iPS細(xì) 胞誘導(dǎo)分化為胰島 3細(xì)胞，以用于I型糖尿病的治療研究。I型糖尿病是由產(chǎn)生胰島素的3細(xì)胞的自身免疫破壞而引起的胰島素缺乏的疾病?，F(xiàn)有的治療方法并不能治愈糖尿病并且無法防止一些并發(fā)癥的產(chǎn)生。通過細(xì)胞移植來治療早期病人和使3細(xì)胞恢復(fù)其功能無疑是一個(gè)比較理想的方法，可以不依賴于胰島素并且防止并發(fā)癥的發(fā)生。但是移植的缺陷在于供體組織的缺乏。當(dāng)前的研究已經(jīng)表明人胚胎干細(xì)胞（hESC）能夠自然地分化為胰島素生成細(xì)胞，能夠 分泌胰島素并表達(dá)特異標(biāo)記。在小鼠中由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的3細(xì)胞移植已經(jīng)已經(jīng)能夠成功治療糖尿病（鏈月尿菌素

10、制作的小鼠模型）6。隨之的研究又進(jìn)一步將 hES細(xì)胞誘導(dǎo)為類似于未成熟的胰島3細(xì)胞的胰島樣細(xì)胞簇，提高了胰島3細(xì)胞的產(chǎn)量。這些研究都為I型糖尿病的治療打下了基礎(chǔ)。7來自Yan Shi等人的研究將誘導(dǎo)的過程簡(jiǎn)化8,提出用actin A和RA聯(lián)合其他的一些胰島成熟因子來誘導(dǎo) ES成為胰島素生成細(xì)胞并獲得成功。actin A為TGF- 3超家族的一員，能夠促進(jìn)最后的內(nèi)胚層分化，在原腸形成中對(duì)內(nèi)胚層和中胚層的形成起重要作用。RA （視黃酸）在脊椎動(dòng)物的神經(jīng)外胚層前后軸形成中是一種很好的特征信號(hào)分子，并且有研究表明RA也參與胚胎內(nèi)胚層分化的調(diào)節(jié)尤其是胰島芽基的形成，同時(shí)能夠提高胰島3細(xì)胞中胰島素的生成。

11、將actin A和RA結(jié)合能夠促使xenopus （爪蟾）囊胚中假定的內(nèi)胚層區(qū)域分化為 胰島素陽(yáng)性細(xì)胞。以往胰島3細(xì)胞的產(chǎn)生是利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行的，我們希望通過iPS也可以分化得到的胰島3細(xì)胞用于治療，已解決胚胎干細(xì)胞來源的問題。B. MethodProduce iPS cells實(shí)驗(yàn)的原理：把老鼠的一種皮膚細(xì)胞纖維原細(xì)胞”進(jìn)行逐漸分離，最后得出新的細(xì)胞形態(tài)。使用一種濾過性病毒載體，將四種轉(zhuǎn)錄子的基因副本，即 Oct4, Sox2, c-Myc ,和Klf4導(dǎo)入正常小 鼠細(xì)胞內(nèi)。因?yàn)橹亟M率只有千分之一，因此需要剔除無用的細(xì)胞。被選出的重組細(xì)胞被稱為多能性引誘干細(xì)胞（iPS）。在新的研究中，把小

12、鼠中得到的重要發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到人體。選擇來自 不同人供體的成人皮膚成纖維細(xì)胞和另外兩種人成纖維細(xì)胞群（來自潤(rùn)滑組織和新生兒包 皮），作為重新編程靶細(xì)胞。 然后用攜帶人 Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體轉(zhuǎn)導(dǎo)人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，之后在人ES細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo) 30天之后，類似人ES細(xì)胞的iPS克隆（在其他克隆之間）覆蓋了培養(yǎng)皿，并可進(jìn)一步擴(kuò)增和擴(kuò)大。在人 iPS形成之后，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使4個(gè)轉(zhuǎn)基因沉默（與在小鼠系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)一樣），這說明iPS細(xì)胞完全重新編程，不再依賴于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。9（A） Time schedule of iPS cell generat

13、ion.ARetroviral ReseedingColonytransduction on Ie銘krpicking up句唯F日0 口-附訪 一訐-dQd30成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS的實(shí)驗(yàn)操作步驟：1、成纖維細(xì)胞的來源與培養(yǎng)來源：成人皮膚成纖維細(xì)胞（ HDF）培養(yǎng)：用含10%小牛血清（FBS）和0.5%青霉素與鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco s modified eagle medium ） 37 C培養(yǎng)2、載體構(gòu)建Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 經(jīng) RT-PCR 擴(kuò)增后構(gòu)入載體 pMXs。3、載體轉(zhuǎn)染PLAT-E packaging細(xì)胞在轉(zhuǎn)染試劑 Fugen

14、e 6存在的情況下，用pMXs載體轉(zhuǎn)染PLAT-E packaging細(xì)胞24小時(shí)。（Plat-E細(xì)胞系：為暫時(shí)包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種有效而穩(wěn)定的系統(tǒng)）4、轉(zhuǎn)染HDF用含有四種逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)液上清轉(zhuǎn)染HDF細(xì)胞，然后培養(yǎng)于含10%小牛血清（FBS）和0.5%青霉素與鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基。5、iPS細(xì)胞的產(chǎn)生轉(zhuǎn)染六天后，用胰蛋白酶處理并轉(zhuǎn)移至用絲裂霉素處理過的SNL feeder cell DMEM 培養(yǎng)基中。一天后，用含有4ng/ml bFGF（basic fibroblast growth factor）的ES細(xì)胞培養(yǎng)基。此后， 每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后的第30天，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)挑出

15、iPS細(xì)胞。將其用PBS清洗并經(jīng)胰蛋白酶/EDTA處理后接種至新鮮 ES細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)，或-80 C冷凍保藏備用。（SNL細(xì)胞系：是在STO飼養(yǎng)層細(xì)胞中轉(zhuǎn) mLIF基因和neo基因的飼養(yǎng)層細(xì)胞株，它能分泌mLIF因子抑制ES的分化。體外培養(yǎng)條件基本同MEF飼養(yǎng)層，但需加 L-谷氨酰胺。）Morphology of HDF.Typical image of non-ES cell-like colony.Typical image of hES cell-like colony.Morphology of established iPS cell line at passage numb

16、er 6.Image of iPS cells with high magni?cation.Spontaneously differentiated cells in the center part of human iPS cell colonies.目前iPS的安全性問題還沒有完全解決。植入細(xì)胞內(nèi)染色體位點(diǎn)上的4個(gè)新的基因，有可能阻斷某些正?；虻墓δ?；并且這4個(gè)基因有可能都是癌基因，存在誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤 的可能。Confirm pluripotence以下常規(guī)實(shí)驗(yàn)被用來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的多能性。Specific gene expression干細(xì)胞中存在幾個(gè)特異表達(dá)的蛋白：S

17、SEA ( Stage specific embryonic antigen ),堿性磷酸酶 ALP , hTERT (human telomerase reverse transcriptase)等。In vitro differentionation在適當(dāng)?shù)臈l彳下培養(yǎng)iPS細(xì)胞，iPS將會(huì)分化為多種細(xì)胞。Teratoma formation將iPS細(xì)胞注射入免疫缺陷小鼠的皮下，iPS將分化為具有三個(gè)胚層特性的畸胎瘤t teratoma)。Chimera formation (形成嵌合體)將iPS細(xì)胞加入囊胚期細(xì)胞中，可以與囊胚細(xì)胞一起發(fā)育，形成嵌合體( chimera), 如果在iPS細(xì)胞

18、中存在標(biāo)記基因如gfp,可以觀察到嵌合胚胎的產(chǎn)生。Tetraploid complementation (四倍體互補(bǔ))將iPS細(xì)胞注入卵裂期4倍體小鼠(電融合產(chǎn)生)，外源二倍體的iPS細(xì)胞將形成胚 胎。四倍體細(xì)胞無法參與胚胎形成， 而是形成胎盤。因此帶有GFP的iPS細(xì)胞形成有熒光的小鼠胚胎，而胎盤無熒光。10Fig. 3 A, chimera formation,上部小鼠為嵌合體小鼠；B. Tetraploid complementation。小鼠有綠色熒光而胎盤沒有熒光。Differentiate to s 3 cell基于前人的一些探索，YAN SHI提出了一種更為方便、快捷、有效的三步

19、誘導(dǎo)法，使PS細(xì)胞分化為胰島素生成細(xì)胞。我們認(rèn)為，作為一種探索，我們也不妨嘗試一下用這種三 步法將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素生成細(xì)胞。其具體步驟如下：第一步：誘導(dǎo)產(chǎn)生 embryonic body (ES)。將iPS細(xì)胞懸浮于添加百分之十 FBS/DMEM 的Petri dishes中。24-48小時(shí)后，收集 ES細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含有百分之十FBS/DMEM Petri dishes(事先經(jīng)過 Matrigel包被)。2小時(shí)后，轉(zhuǎn)入添加 activin A的FBS/DMEM 中培養(yǎng)24小時(shí)。 然后轉(zhuǎn)入新的FBS/DMEM 中6-8小時(shí)。再轉(zhuǎn)入添加 R A的FBS/DMEM中培養(yǎng)24小時(shí)。第二步：擴(kuò)大

20、培養(yǎng)能產(chǎn)生胰島素的前體細(xì)胞。將已分化的ES細(xì)胞于添加百分之十FBS/DMEM 和10ng/ml基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF;Sigma)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3-5天。以下是參考實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖一經(jīng)此步驟后細(xì)胞的基因表達(dá)。Hnf3 3insulinl是胰島3細(xì)胞田七匚日14M%ih喝4c :h1口，*亡力-KI LjLlijk第三步，誘導(dǎo)該細(xì)胞成熟。將第二步中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入添加胰島特異表達(dá)的基因。3細(xì)胞成熟促進(jìn)劑(N2 ,B27, laminin , bFGF, , nicotinamide ）的 DMEM/F12 中培養(yǎng) 3-5 天，在顯微鏡下進(jìn)行形 態(tài)觀察。以下是參考實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖 一經(jīng)此步驟后細(xì)胞

21、的基因表達(dá):第一道（胰腺）：成熟的小鼠胰腺樣本作為陽(yáng)性對(duì)照；第二道（-）：不加activin A和RA誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)過三個(gè)步驟的基因表達(dá)；第三道（+）：加activin A和RA誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)過三個(gè)步驟的基因表達(dá)；第四道（RT）：為第三道的樣本，但是在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)未加逆轉(zhuǎn)錄酶。卜圖為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，證明 activin A和RA聯(lián)合作用的效果：aciiviu A-i-RA-ac L i v 11 .A R A-上面行顯示只加activin A時(shí)hnf3 3和pdx-1有表達(dá)，下面行顯示只加 RA時(shí)只有hnf3裱達(dá)。 以下是將誘導(dǎo)得到的陽(yáng)性細(xì)胞移植入糖尿病小鼠腎臟后的結(jié)果。B-I一2010-ICL 二

22、。qnMMpoaa.5JO Alyncud.o一 BA-AJnRA Cell加 cctedPBS-irycdedA.移植分化后的細(xì)胞的小鼠存活率達(dá)到70%,而對(duì)照組移植磷酸緩沖液的小鼠存活率只有25%,說明移植的治療作用。B.移植分化后的細(xì)胞的小鼠血糖濃度降低，而對(duì)照組移植磷酸緩沖液的小鼠血糖濃度 仍然很高 檢測(cè)方法：.可在細(xì)胞中引入相應(yīng)熒光蛋白標(biāo)簽，以檢測(cè)不同階段胰島素的生成。.相應(yīng)胰島細(xì)胞標(biāo)志基因（insulinI, pdxl, glut2, hnf3 ）的莪遺皿通過 RT-PCR進(jìn)行 檢測(cè)。.胰島素在特定組織中的表達(dá)可通過免疫組化來檢測(cè)。以下為參考實(shí)驗(yàn)中通過IHC檢測(cè)的胰島素生成和C-p

23、eptide生成:I抗為胰島素抗體，顯示胰島素陽(yáng)性I抗為C-peptide抗體，顯示C-peptide陽(yáng)性.可通過測(cè)驗(yàn)其胰島素的分泌量與環(huán)境中的葡萄糖濃度的相關(guān)性來檢測(cè)該細(xì)胞的分泌 特性。(Mluoloslux以下是參考實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖, 通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)來檢測(cè)對(duì)葡萄 糖的反應(yīng)：加入一定量的葡萄糖介質(zhì)后的胰島素生成量比未加時(shí)胰島素生成量多出五倍。.可通過植入糖尿病小鼠的腎小泡來觀察其在體內(nèi)的表現(xiàn)。原理：參考文獻(xiàn)中對(duì)各因子的可能作用作了一些討論，但并未提出具體通路，見Inducing Embryonic Stem Cells to Differentiate into Pancreatic Cell

24、s by a Novel Three-Step Approach with Activin A and All-Trans Retinoic Acid 的討論部分。缺點(diǎn)：可能誘發(fā)腫瘤形成，可在阻斷腫瘤形成通路上作進(jìn)一步的完善。REFERENCE LISTTakahashi K . & Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. 126(4), 663. 2006. Cell.Ref Type: Gene

25、ricJunying Yu. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells 318(5858), 1917. 2007. Science.Ref Type: GenericLaurie A Boyer. The reprogramming language of pluripotency. 18, 123. 2008. Current Opinion in Genetics & Development.Ref Type: GenericNakagawa M, K. M. T. K. T. K. I. T

26、. A. T. O. K. M. Y . T. N. Y. S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. 26(1), 101. 2008. Nature Biotechnology.Ref Type: GenericJacob Hanna & Rudolf Jaenisch. Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. 318(5858), 1920. 20