1、高產(chǎn)酸性-葡萄糖苷酶的優(yōu)良本土酵母菌株篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析葡萄酒釀造中，非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)是有別于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的一大類酵母菌，它們廣泛存在于葡萄園土壤、果實(shí)表皮和釀酒過程中，主要包括有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)、畢赤酵母屬(Pichia)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、假絲酵母屬(Candida)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)等1-3。其中，一些非釀酒酵母具有獨(dú)特的代謝通路和較強(qiáng)的酶活力，可以降低酒精的生成，增加甘油、

2、萜烯和酯類含量，釋放甘露糖蛋白或多糖改善口感，增強(qiáng)顏色穩(wěn)定性4。利用一些非釀酒酵母的優(yōu)勢使其在受控的條件下參與或輔助葡萄酒釀造，能夠?qū)ζ咸丫频娘L(fēng)味產(chǎn)生積極影響4。與釀酒酵母相比，一些非釀酒酵母能夠代謝產(chǎn)生大量的-葡萄糖苷酶5。-葡萄糖苷酶作為一種纖維素類水解酶能夠水解糖苷結(jié)合態(tài)物質(zhì)中的糖苷鍵釋放香氣物質(zhì)，促進(jìn)一些萜烯類和C13-降異戊二烯類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而增加葡萄酒的花香、果香和堅(jiān)果香，對于改善或增強(qiáng)葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性有重要作用6-7。JOLLY等8報(bào)道了畢赤酵母屬(Pichia)酵母菌株具有代謝產(chǎn)生高-葡萄糖苷酶活力的潛力；KONG等9將具有高-葡萄糖苷酶活力的發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafe

3、rmentans)和膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)胞外酶添加到黑比諾葡萄酒中，明顯增加了酒體的花果香氣。然而，傳統(tǒng)的釀酒條件(如高濃度糖、高酒精度、高濃度SO2和低pH值)可能會抑制發(fā)酵體系中-葡萄糖苷酶活力，導(dǎo)致其無法充分水解糖苷鍵9。研究表明，酵母菌的分布與地理位置和氣候條件等密切相關(guān)10。目前，世界上許多著名葡萄酒產(chǎn)地的本土酵母菌已被廣泛研究。我國酵母資源豐富，為改善葡萄酒的香氣，促進(jìn)產(chǎn)區(qū)葡萄酒風(fēng)土表達(dá)，特別是對于一些特色酒莊，應(yīng)用高產(chǎn)-葡萄糖苷酶的本土酵母來生產(chǎn)具有獨(dú)特風(fēng)格的葡萄酒是一條重要途徑。因此，篩選來自本土高產(chǎn)-葡萄糖苷酶且耐受性優(yōu)良的非釀酒酵母菌株

4、對提高葡萄酒香氣具有重要的意義。本文以452株本土非釀酒酵母菌為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)其發(fā)酵能力、產(chǎn)-葡萄糖苷酶能力、耐受性等進(jìn)行了篩選研究，并進(jìn)一步分析了上述菌株的-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)，旨在得到具有高產(chǎn)酸性-葡萄糖苷酶及對葡萄酒生境耐受性優(yōu)良的非釀酒酵母菌株，并為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。2.2 高產(chǎn)-葡萄糖苷酶菌株的初篩2.3 菌株的耐受性分析2.4 高產(chǎn)-葡萄糖苷酶菌株的復(fù)篩通過測定6株供試菌株的-葡萄糖苷酶活力(圖4)。結(jié)果表明，菌株GC204、NM218、BF345的酶活力顯著高于菌株ZC278、ZC287、BF370，分別為54.34、49.5、46.42 mU/mL。2.5 -葡萄糖苷酶

5、酶學(xué)性質(zhì)分析溫度會影響酶催化反應(yīng)的速度以及酶蛋白的穩(wěn)定性。由圖5-A可知，溫度為1070 時(shí)，菌株GC204、NM218、BF345的-葡萄糖苷酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；反應(yīng)溫度為40 時(shí)，3株菌酶活力達(dá)到最大值，GC204為47.95 mU/mL，NM218為47.08 mU/mL，BF345為49.42 mU/mL；當(dāng)溫度為70 時(shí)，3株菌酶活降低了34.58%39.11%。pH值會影響酶的構(gòu)象，還會影響酶與底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和穩(wěn)定性。由圖5-B可知，菌株NM218和BF345的-葡萄糖苷酶最適pH值為4.0，是弱酸性酶，其酶活力分別為49.70、50.78 mU/mL

6、；而菌株GC204的-葡萄糖苷酶在pH值為7.0時(shí)的酶活力達(dá)到最大，為54.40 mU/mL，是中性酶。金屬離子和酶抑制劑對菌株GC204、NM218、BF345的-葡萄糖苷酶影響如圖5-C所示，濃度為5 mmol/L的Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+對3株菌的酶活力具有明顯的激活作用，促使酶活力上升了23.72%70.72%，而Cu2+對酶活力具有明顯的抑制作用，酶活力下降了14.87%32.89%。4種酶抑制劑對菌株GC204的-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出明顯的抑制作用，酶活力下降了33.93%45.41%，而4種酶制劑對NM218和BF345的-葡萄糖苷酶的抑制效果不明顯，酶活力僅下降了2.

7、71%7.66%。不同糖底物(葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖和纖維二糖)對菌株GC204、NM218、BF345酶活力的影響如圖5-D所示，9種糖底物對-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出激活作用，其中纖維二糖對3株菌株的酶活力激活作用尤為明顯，將酶活力提高了25.67%40.80%；葡萄糖、麥芽糖和蔗糖將菌株GC204的酶活力提高了10.43%18.52%；而除纖維二糖以外的其他不同糖底物對NM218和BF345的酶活力激活效果不明顯。圖4 試驗(yàn)菌株-葡萄糖苷酶活力Fig.4 -glucosidase activity of the test strain注：不同小寫字母代表差異

8、顯著(P0.05)A-溫度；B-pH值；C-不同金屬離子及酶抑制劑；D-糖底物圖5 溫度、pH值、不同金屬離子及酶抑制劑和糖底物對酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature, pH, different metal ions and enzyme inhibitors and sugar substrates on enzyme activity2.6 優(yōu)選菌株的菌屬鑒定葡萄酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值一般在3.54.5，所以選取具有弱酸性酶活力的菌株NM218和BF345進(jìn)行下一步試驗(yàn)。通過對其進(jìn)行26S rDNA D1/D2測序,如表1所示。表1 試驗(yàn)菌株26S r

9、DNA D1/D2區(qū)域序列測序結(jié)果Table 1 Sequencing results of the 26S rDNA D1/D2 region of the test strain并利用NCBI數(shù)據(jù)庫對菌株NM218與Meyerozymaguilliermondii菌株進(jìn)行Blast同源序列比對，其相似性為99.51%，因此，菌株NM218被鑒定為季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)。同時(shí)，比對菌株BF345與Hanseniasporauvarum菌株序列，相似性為99.83%，因此，菌株BF345被鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)。3 討論酵母菌在葡萄酒釀造中具有

10、重要作用，優(yōu)質(zhì)葡萄酒的釀造依賴于優(yōu)良微生物菌種的開發(fā)利用。葡萄酒發(fā)酵初期的低pH、高糖、高SO2以及逐漸增高的乙醇體積分?jǐn)?shù)這些環(huán)境因子能夠影響酵母菌群的生長動態(tài)，從而影響酒精發(fā)酵，因此酵母菌株對葡萄酒生境下的耐受性是決定其能否應(yīng)用于葡萄酒釀造的重要前提條件。本研究通過篩選獲得1株季也蒙畢赤酵母(M.guilliermondii)菌株NM218和1株葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)菌株BF345，這2株菌均能夠在350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH值2.5和6%乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下生長，具有較好的耐受性。PERRUSQUA-LUEVANO等18研究發(fā)現(xiàn)的1株H.uvarum

11、菌株能夠耐受350 g/L葡萄糖和100 mg/L SO2，劉曉柱等19發(fā)現(xiàn)的1株H.uvarumF119菌株能夠耐受300 mg/L的SO2質(zhì)量濃度、pH值2.0和8%乙醇；這些結(jié)果雖然與本研究結(jié)果有一定的差異，但也說明H.uvarum菌株具有在葡萄酒生境下正常生長的潛力，但考慮其能夠耐受6%乙醇這一特性，在應(yīng)用方面適合在釀酒前期使用。高產(chǎn)-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母能夠增加揮發(fā)性化合物含量，從而提高葡萄酒的感官復(fù)雜性和某些發(fā)酵參數(shù)20-21。本研究中篩選得到的菌株NM218和BF345的-葡萄糖苷酶活力可達(dá)49.5、46.42 mU/mL。尹薦等22發(fā)現(xiàn)膠紅酵母和發(fā)酵畢赤酵母有較高的-葡萄糖苷

12、酶活力，分別為41.81、30.42 mU/mL。因此，本文篩選得到的菌株NM218和BF345具有較高的-葡萄糖苷酶活力。微生物源-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)因菌種、菌株不同而有較大差異，其適用范圍也隨之不同。已報(bào)道的微生物源-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)pH值為3.57.0，以pH值4.06.0常見；最適反應(yīng)溫度在4070 ，常為55 ，部分為6570 23-24。工業(yè)葡萄酒發(fā)酵過程中原料葡萄汁的pH值多在3.54.5，酒精發(fā)酵過程的溫度控制在3035 25，因此，要充分利用酵母產(chǎn)生的-葡萄糖苷酶，則對其最適反應(yīng)溫度和pH值提出了要求。DA SILVA等23研究發(fā)現(xiàn)Pichiaguilliermondii

13、G1.2產(chǎn)生的-葡萄糖苷酶pH3.55.5及溫度55 時(shí)活性最高；王彩肖26研究發(fā)現(xiàn)3株自選酵母和5株商用酵母中-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為50 ；來自吐魯番盆地的5株高產(chǎn)-葡萄糖苷酶的酵母菌株在pH 5.0時(shí)表現(xiàn)出高活性27。這些菌株產(chǎn)生的-葡萄糖苷酶尚無法滿足實(shí)際葡萄酒釀造的需求。本研究中菌株NM218和BF345的酶活力最適反應(yīng)溫度為40 ，最適pH值為4.0，能基本滿足在釀酒期間的溫度和低pH值條件，說明菌株具有在葡萄酒發(fā)酵過程發(fā)揮作用的潛力。4 結(jié)論本研究從452株本土非釀酒酵母菌株中初步篩選獲得了34株發(fā)酵能力較好且高產(chǎn)-葡萄糖苷酶的菌株。經(jīng)耐受性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370對葡萄糖、SO2、酒精度和pH值均具有較好的耐受性。同時(shí)，復(fù)篩及酶學(xué)性質(zhì)分析表明，菌株NM218和BF345具有較高的-葡萄糖苷酶活力，分別為49.5和46.42 mU/mL，酶促反應(yīng)最適溫度為